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目的
多重耐药革兰氏阴性菌(Multidrug-resistant Gram negative bacteria，MDR-GNB)严重威胁人类健康，已成为重症感染死亡的重要原因。2017年世界卫生组织(WHO)公布的12种最具威胁力、最迫切需求新型抗菌药物的“超级细菌”中，位居前三位的分别是耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和耐碳青霉烯类且产超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌属，均为临床感染最为常见的革兰氏阴性菌，因此研制治疗MDR-GNB的新型抗菌药物迫在眉睫。反义抗菌策略是以细菌内生存必需基因、毒力及耐药相关基因作为靶点，人工合成与之互补的反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides，ASOs)分子，阻断上述基因表达，达到抑制细菌生长或者逆转细菌耐药性的目的。我们课题组前期证实以ASOs阻断mecA、mecR1、oprM、ftsZ、rpoD等多个靶标基因后，可以逆转细菌耐药性、抑制或杀灭细菌，在体内外有效发挥抗菌活性。与传统抗菌药物相比，ASOs具有特异性强，不易诱导耐药，设计简单快速，合成成本低等优点。因此，反义抗菌策略为当前严峻的抗菌新药物研究形势带来了新希望。
然而，ASOs分子量大，亲水性强，荷负电荷，游离ASOs很难穿透胞膜进入细菌内。如何实现ASOs在细菌内的高效递送是反义抗菌领域亟待突破的难点和重点。透膜肽(Cell penetrating peptide，CPP)与ASOs共价偶联是目前向细菌内递送ASOs领域研究最多、最为广泛的递送策略。但将CPP与ASOs共价相连接后普遍存在ASOs基因阻断效率不同程度地降低、载药率低、合成纯化困难，成本高昂等问题，因而制约了其向应用阶段的发展。而CPP与ASOs非共价结合策略则是将CPP与ASOs通过静电和疏水作用形成纳米复合物，其合成制备相对容易，载药量大，适用范围广，其有效性已经在哺乳动物细胞药物递送领域研究中得到普遍证实。我们课题组前期以亮氨酸-色氨酸-精氨酸为基本重复序列，设计多条含有四个末端分枝的多肽—分枝状多肽(Dendritic poly-peptide，DPP)，采用非共价结合策略制备了DPP/ASOs纳米粒，证实DPP/ASOs能有效将ASOs递送至细菌中，并初步明确了DPP电荷分布、亲水/疏水程度及是否含有组氨酸等因素与递送效率密切相关。研究结果提示，DPP是一类极具前景的向细菌递送ASOs的载体。
但是，我们前期研究发现该DPP/ASOs递送系统尚存在以下问题：①电荷及组氨酸数量是否影响DPP的递送效率？哪些参数才是影响细菌转化效率的主要因素？②原有的DPP/ASOs系统只能在水中稳定有效，如何进一步提高递送系统在复杂溶液中的稳定性以更好的发挥药效？③怎样提高DPP递送系统的细菌靶向性。为解决上述问题，本课题以ESBLs-E.coli和MDR-A.baumannii为研究对象，以针对生存必需基因acpP(编码酰基转运蛋白)设计的ASOs分子为模型药物，开展以下研究：①优化DPP/ASOs递送系统，包括DPP序列设计和辅助剂选择；②设计并合成能特异性识别A.baumannii的适配体衍生物Apt-PEG2000-DSPE；③以DPP/ASOs为内核，以Apt-PEG2000-DSPE为外壳，构建全新的靶向A.baumannii递送系统，全面评价该系统的靶向递送效率与抗菌效果。通过以上研究，旨在揭示DPP作为细菌内ASOs递送载体的序列及结构特征，明确适配体介导的细菌特异性识别功能，证实该系统体内外的抗菌活性，为反义抗菌策略的研究探索新路径、提供新思路、新依据和新信息。
方法
1.基于DPP的ASOs递送系统的设计与评价
1.1DPP的设计
我们前期筛选得到的DPP7载体可将ASOs高效递送入多种细菌内发挥抗菌作用。为进一步明确电荷和组氨酸数量对DPP递送效率的影响，我们在DPP7基础上，进一步优化设计5条DPP(DPP8-DPP12)。
1.2DPP/ASOs的制备、表征及稳定性研究
将DPP与ASOs按氮磷比为8∶1的比例混合，37℃孵育，形成DPP/ASOs纳米粒，利用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering，DLS)检测DPP/ASOs粒径；通过检测细菌培养基中DPP/ASOs粒径评价其稳定性；采用荧光分光光度法测定DPP对ASOs的包封率。
1.3DSPE-mPEG2000修饰的DPP/ASOs纳米粒(DP-AD)的制备、表征及稳定性研究
首先，通过流式细胞术测定纳米粒的递送效率和生长曲线法测定纳米粒的抗菌活性来筛选DSPE-mPEG2000的最佳比例，并按此比例制备DP-AD，通过DLS和透射电镜对其表征；通过比较M-H肉汤和水中DP-AD的粒径检测其稳定性。
1.4DP-AD递送效率的筛选评价
以E.coli和A.baumannii为研究对象，采用流式细胞术以细菌阳性率为指标评价细菌对DP-AD的摄取，采用生长曲线法评价DP-ADanti-acpP的体外抗菌活性。
2.DP-AD7向细菌内递送ASOs的抗菌活性研究
2.1不同细菌对DP-AD7的摄取研究
实验菌株为ESBLs-E.coli，MDR-A.baumannii，ESBLs-K.pneumonia，MDR-P.Aeruginosa，MRSA，E.faecalis，耐甲氧西林表皮葡萄球菌和B.subtilis。FAM标记的DP-AD7与细菌共孵育，流式细胞术和激光共聚焦评价细菌的摄取。
2.2DP-AD7anti-acpP的体外抗菌活性
实验菌株选用ESBLs-E.coli和MDR-A.baumannii。通过生长曲线测定DP-AD7对细菌生长的抑制作用，RT-PCR法检测DP-AD7anti-acpP对细菌靶基因表达的抑制效应。
2.3DP-AD7anti-acpP的体内抗菌活性
小鼠腹腔注射cy5标记的DP-AD7后，通过活体成像系统观察DP-AD7在小鼠体内各脏器中的分布。然后，小鼠腹腔注射ESBLs-E.coli构建脓毒症模型，感染后腹腔给予不同治疗，观察小鼠存活率，计数小鼠脏器荷菌量并进行病理学检验。
3.细菌靶向配体Apt-PEG2000-DSPE的设计合成及评价
3.1靶向A.baumannii的适配体优化设计与筛选
首先，合成FAM标记全长适配体(Aci49F和Aci55F)和去掉引物的适配体(Aci49T和Aci55T)，通过流式细胞术测定适配体与细菌的结合率(即细菌的阳性率)，筛选最佳的适配体序列。然后将适配体进行不同的化学修饰后，通过流式细胞法筛选得到亲和力最强的适配体用于后续研究。
3.2适配体稳定性、特异性及亲和力的测定
制备浓度梯度的适配体溶液，分别与细菌共孵育，检测细菌结合率，拟合曲线并得到亲和力常数Kd。然后将适配体与A.baumannii和B.subtilis混合菌液共孵育后，荧光显微镜下观察适配体与细菌结合率，测定适配体对A.baumannii的特异性。将适配体用50%血清或者10U/mLDNA酶处理后，通过琼脂糖凝胶电泳测定适配体的稳定性。
3.3DSPE-PEG2000修饰的适配体(Apt-PEG2000-DSPE)的合成与评价
利用马来酰胺基(-Mal)和巯基(-SH)反应，将适配体与DSPE-PEG2000共价连接得到Apt-PEG2000-DSPE，透析纯化后，1H-NMR进行鉴定。采用流式细胞术和荧光显微镜评价适配体的亲和力和特异性。
4.Apt-DP-AD7的制备表征以及对A.baumannii的靶向性抗菌研究
4.1Apt-DP-AD7中Apt-PEG2000-DSPE比例的筛选及表征
制备DPP7/ASOs纳米粒，然后按照Apt-PEG2000-DSPE与DSPE-mPEG2000不同摩尔比例制备Apt-DP-AD7，并通过DLS和透射电镜进行表征。通过生长曲线法检测不同摩尔比例的Apt-DP-AD7anti-acpP处理对细菌生长的抑制，筛选Apt-PEG2000-DSPE的最佳比例。
4.2Apt-DP-AD7对A.baumannii特异性识别及细菌对Apt-DP-AD的摄取研究
用FAM标记的Apt-DP-AD7与A.baumannii和B.subtilis混合菌液共孵育后，通过荧光显微镜观察Apt-DP-AD7对A.baumannii的特异性。用FAM的Apt-DP-AD7与A.baumannii共孵育后，通过流式细胞术检测细菌对Apt-DP-AD7的摄取率。
4.3Apt-DP-AD7anti-acpP的体内外抗菌活性研究
通过生长曲线和RT-PCR法测定Apt-DP-AD7anti-acpP对MDR-A.baumannii生长和靶基因表达的抑制。通过腹腔感染MDR-A.baumannii构建小鼠脓毒症模型，腹腔给予不同治疗，观察小鼠生存率，并观察小鼠脏器的病理损伤。
结果
1.基于DPP的ASOs递送系统的设计、构建与评价
1.1DPP/ASOs纳米粒表征
DLS结果显示，含有10个或者8个正电荷的DPP7/ASOs，DPP8/ASOs，DPP9/ASOs和DPP11/ASOs的粒径约为120nm，而含有6个正电荷的DPP10/ASOs和DPP12/ASOs的粒径都大于300nm。荧光分光光度法显示，除DPP10和DPP12外，所有DPP对ASOs的包封率约为85%以上。当DPP/ASOs纳米粒用等体积M-H肉汤稀释后，所有纳米粒粒径均显著性增大，提示DPP/ASOs纳米粒在复杂溶液中不稳定。
1.2DSPE-mPEG2000修饰的DPP/ASOs纳米粒(DP-AD)的制备、表征及稳定性研究
流式细胞术筛选结果显示，当DSPE-mPEG2000与ASOs摩尔比例为0.5∶1时，细菌在培养基中对DP-AD7摄取率能达到90%以上，与细菌在水中对DPP7/ASOs的摄取无差异。若DSPE-mPEG2000与ASOs摩尔比例高于或者低于0.5∶1，细菌摄取率都不同程度降低，生长曲线结果进一步证实，该比例的DP-AD7anti-acpP处理ESBLs-E.coli后，细菌生长受到显著抑制，而DSPE-mPEG2000比例增大或减少，均会导致DP-AD7anti-acpP抗菌活性降低。我们采用DSPE-mPEG2000与ASOs摩尔比例为0.5∶1作为制备DP-AD的最佳比例。
按DSPE-mPEG2000与ASOs摩尔比为0.5∶1制备DP-AD，DLS结果显示，含有10个或者8个正电荷的DP-AD7、DP-AD8、DP-AD9和DP-AD11粒径约为120-150nm，zeta电位在25mV至35mV之间，而含有六个正电荷的DP-AD10和DP-AD12粒径都大于350nm，zeta电位约为10mV，提示DPP10和DPP12由于正电荷数量较少，不能与ASOs形成稳定纳米粒。M-H肉汤稀释后，DP-AD7、DP-AD8、DP-AD9和DP-AD11纳米粒粒径与水中粒径相比无显著性差异，提示DP-AD能在M-H肉汤中保持稳定。TEM结果显示，所有DP-AD都呈球形，粒径约为70nm，但DP-AD10和DP-AD12纳米粒之间出现明显粘连，提示正电荷数量对形成稳定的DP-AD起着重要作用。
1.3DP-AD递送效率的筛选评价
流式细胞术检测结果显示，E.coli、S.aureus、A.baumannii分别与序列中含有10个正电荷、2个组氨酸的DP-AD7共孵育后，细菌摄取率均在90%以上；而含有8个正电荷、2个组氨酸的DP-AD8与细菌共孵育后，细菌摄取率均大于90%，但A.baumannii荧光强度相对较低；含有4个组氨酸且正电荷数量分别为10和8的DP-AD11和DP-AD9与细菌共孵育后，细菌摄取率均小于60%；与只含有6个正电荷的DP-AD10和DP-AD12共孵育后，细菌摄取率均低于10%。生长曲线结果证实，仅有DP-AD7anti-acpP和DP-AD8anti-acpP能有效抑制ESBLs-E.coli和A.baumannii的生长，且DP-AD7anti-acpP抗菌活性优于DP-AD8anti-acpP，而同浓度的其余DP-ADanti-acpP纳米粒均无抑制效果。。以上结果提示，含有10个正电荷和2个组氨酸的DP-AD7递送效率最高、抗菌活性最强，故用于下一步研究。
2.ASOs递送系统DP-AD7anti-acpP的体内外抗菌活性研究
2.1不同细菌对DP-AD7的摄取研究
流式细胞术检测结果显示，FAM标记的DP-AD7与细菌共孵育后，所有测试菌的摄取率都在90%以上；激光共聚焦结果进一步证实，DP-AD7可被B.subtilis和ESBLs-E.coli有效摄取。
2.2DP-AD7anti-acpP的体外抗菌活性
DP-AD7anti-acpP处理后，ESBLs-E.coli和A.baumannii生长曲线和RT-PCR结果显示，DP-AD7能够浓度依赖性显著抑制细菌的生长，抑制细菌靶基因的表达。
2.3DP-AD7anti-acpP的体内抗菌活性
活体成像结果表明，腹腔注射2h后，DP-AD7主要分布在小鼠的肝和肾。脓毒症小鼠实验结果显示，感染13h后，模型组小鼠生存率为0%，而给予0.5mg/kg和1.5mg/kgDP-AD7anti-acpP治疗组的小鼠生存率分别达到50%和87.5%，对应错配组小鼠生存率仅为12.5%和37.5%。菌落CFU计数结果显示，DP-AD7anti-acpP可剂量依赖性降低感染小鼠肝肾组织中的荷菌量；HE染色进一步显示，DP-AD7anti-acpP可剂量依赖性减轻感染小鼠肝脏和肾脏的病理损伤。
3.细菌靶向配体Apt-PEG2000-DSPE的设计合成及评价
3.1靶向A.baumannii适配体的设计、合成及筛选
流式结果显示，FAM标记的全长Aci49F和Aci55F以及去掉引物的Aci49T和Aci55T处理后，A.baumannii(ATCC19606)结合率分别为52%、40.5%、57%和30%。提示去掉引物的Aci49T对A.baumannii亲和力最强，作为后续研究的对象。Aci49T经2’-OMe(Aci49T-1)和PS(Aci49T-2)修饰后与A.baumannii共孵育，适配体与细菌结合的结合率分别为40%和60%，提示Aci49T-2与A.baumannii的亲和力最强，作为下一步研究对象。
3.2适配体亲和力、特异性及稳定性的测定
亲和力分析结果显示，Aci49T-2对A.baumannii(ATCC19606)的亲和力常数Kd为0.015μM，适配体与细菌的最大结合率为54%。将Aci49T-2与A.baumannii和B.subtilis混合菌液共孵育后，荧光显微镜下观察发现，A.baumannii显示明显绿色荧光，而B.subtilis几乎没有绿色荧光。提示Aci49T-2保持了对A.baumannii的特异性。用血清和DNA酶处理后，凝胶电泳结果显示，三种化学修饰的适配体的血清稳定性和酶稳定性都明显增加。
3.3Apt-PEG2000-DSPE的鉴定与评价
Apt-PEG2000-DSPE的1H-NMR显示，马来酰氨基特征峰(δ=6.7)消失，而其它峰能与DSPE-PEG2000以及Aci49T-2高度重合，产物成功合成。流式结果显示，Apt-PEG2000-DSPE对A.baumannii的结合率与Aci49T-2保持一致，约50%，说明产物保持了对A.baumannii的亲和力，FAM标记的Apt-PEG2000-DSPE与A.baumannii和B.subtilis混合菌液共孵育后，荧光显微镜观察结果发现，A.baumannii显示明显的绿色荧光，而B.subtilis则没有荧光，说明Apt-PEG2000-DSPE保持了对A.baumannii的特异性。
4.Apt-DP-AD7制备表征以及对A.baumannii的靶向性抗菌研究
4.1Apt-DP-AD7中Apt-PEG2000-DSPE比例的筛选及纳米粒表征
DLS结果显示，不同Apt-PEG2000-DSPE比例的Apt-DP-AD7粒径在110-130nm之间，zeta电位为25mV至35mV之间；TEM结果显示Apt-DP-AD7呈球形，粒径约为70nm。生长曲线结果显示，当Apt-PEG2000-DSPE与DSPE-mPEG2000摩尔比例为1∶2、1∶5或1∶10时，Apt-DP-AD7处理组与对应错配组的细菌生长无显著差异，说明Apt-PEG2000-DSPE比例太高会降低DP-AD7的抗菌活性。当Apt-PEG2000-DSPE与DSPE-mPEG2000摩尔比例为1∶20和1∶40时，与错配组相比，Apt-DP-AD7能显著抑制细菌的生长。为保证Apt-DP-AD的靶向功能，以Apt-PEG2000-DSPE与DSPE-mPEG2000摩尔比例为1∶20制备纳米粒进行下一步研究。
4.2Apt-DP-AD7对A.baumannii特异性识别及细菌对Apt-DP-AD的摄取研究
荧光显微镜观察结果显示，与Apt-DP-AD7共孵育后，A.baumannii有较强绿色荧光，而B.subtilis荧光较弱。说明Apt-DP-AD7保持对A.baumannii的特异性。流式细胞术结果显示，Apt-DP-AD7对ASOs在A.baumannii的递送效率与DP-AD7没有显著性差异。
4.3Apt-DP-AD7anti-acpP的体内外抗菌活性
生长曲线结果显示，Apt-DP-AD7anti-acpP能够显著抑制所有五株敏感和耐药的A.baumannii(ATCC19606、XJ17014279、XJ17014346、XJ17014350和XJ17014362)的生长。同样，RT-PCR结果显示，Apt-DP-AD7anti-acpP能够浓度依赖性抑制所有五株A.baumannii靶基因的表达。动物实验结果显示，模型组小鼠于24h内全部死亡，而给予0.5mg/kg和1.5mg/kgApt-DP-AD7anti-acpP治疗后，小鼠的生存率分别达到了50%和87.5%，给予1.5mg/kgDP-AD7治疗小鼠生存率为62.5%。小鼠脏器HE染色结果显示，Apt-DP-AD7anti-acpP有效降低肝肾肺组织损伤，显示明显的动物保护效应。
结论
1.两亲性DPP作为ASOs细菌内递送载体设计的理想要求：正电荷数量为8-10个；组氨酸数量为2个。
2.以DPP7包裹ASOs为内核，以DSPE-PEG为外壳构建的DP-AD7，是一种新型的体内外均有效的ASOs抗菌分子递送系统。
3.Aci49T-2适配体修饰的DP-AD7(Apt-DP-AD7)，能靶向识别A.baumannii，提高DP-AD7anti-acpP的抗菌活性，为ASOs细菌靶向递送提供新策略。
多重耐药革兰氏阴性菌(Multidrug-resistant Gram negative bacteria，MDR-GNB)严重威胁人类健康，已成为重症感染死亡的重要原因。2017年世界卫生组织(WHO)公布的12种最具威胁力、最迫切需求新型抗菌药物的“超级细菌”中，位居前三位的分别是耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和耐碳青霉烯类且产超广谱β-内酰胺酶的肠杆菌属，均为临床感染最为常见的革兰氏阴性菌，因此研制治疗MDR-GNB的新型抗菌药物迫在眉睫。反义抗菌策略是以细菌内生存必需基因、毒力及耐药相关基因作为靶点，人工合成与之互补的反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides，ASOs)分子，阻断上述基因表达，达到抑制细菌生长或者逆转细菌耐药性的目的。我们课题组前期证实以ASOs阻断mecA、mecR1、oprM、ftsZ、rpoD等多个靶标基因后，可以逆转细菌耐药性、抑制或杀灭细菌，在体内外有效发挥抗菌活性。与传统抗菌药物相比，ASOs具有特异性强，不易诱导耐药，设计简单快速，合成成本低等优点。因此，反义抗菌策略为当前严峻的抗菌新药物研究形势带来了新希望。
然而，ASOs分子量大，亲水性强，荷负电荷，游离ASOs很难穿透胞膜进入细菌内。如何实现ASOs在细菌内的高效递送是反义抗菌领域亟待突破的难点和重点。透膜肽(Cell penetrating peptide，CPP)与ASOs共价偶联是目前向细菌内递送ASOs领域研究最多、最为广泛的递送策略。但将CPP与ASOs共价相连接后普遍存在ASOs基因阻断效率不同程度地降低、载药率低、合成纯化困难，成本高昂等问题，因而制约了其向应用阶段的发展。而CPP与ASOs非共价结合策略则是将CPP与ASOs通过静电和疏水作用形成纳米复合物，其合成制备相对容易，载药量大，适用范围广，其有效性已经在哺乳动物细胞药物递送领域研究中得到普遍证实。我们课题组前期以亮氨酸-色氨酸-精氨酸为基本重复序列，设计多条含有四个末端分枝的多肽—分枝状多肽(Dendritic poly-peptide，DPP)，采用非共价结合策略制备了DPP/ASOs纳米粒，证实DPP/ASOs能有效将ASOs递送至细菌中，并初步明确了DPP电荷分布、亲水/疏水程度及是否含有组氨酸等因素与递送效率密切相关。研究结果提示，DPP是一类极具前景的向细菌递送ASOs的载体。
但是，我们前期研究发现该DPP/ASOs递送系统尚存在以下问题：①电荷及组氨酸数量是否影响DPP的递送效率？哪些参数才是影响细菌转化效率的主要因素？②原有的DPP/ASOs系统只能在水中稳定有效，如何进一步提高递送系统在复杂溶液中的稳定性以更好的发挥药效？③怎样提高DPP递送系统的细菌靶向性。为解决上述问题，本课题以ESBLs-E.coli和MDR-A.baumannii为研究对象，以针对生存必需基因acpP(编码酰基转运蛋白)设计的ASOs分子为模型药物，开展以下研究：①优化DPP/ASOs递送系统，包括DPP序列设计和辅助剂选择；②设计并合成能特异性识别A.baumannii的适配体衍生物Apt-PEG2000-DSPE；③以DPP/ASOs为内核，以Apt-PEG2000-DSPE为外壳，构建全新的靶向A.baumannii递送系统，全面评价该系统的靶向递送效率与抗菌效果。通过以上研究，旨在揭示DPP作为细菌内ASOs递送载体的序列及结构特征，明确适配体介导的细菌特异性识别功能，证实该系统体内外的抗菌活性，为反义抗菌策略的研究探索新路径、提供新思路、新依据和新信息。
方法
1.基于DPP的ASOs递送系统的设计与评价
1.1DPP的设计
我们前期筛选得到的DPP7载体可将ASOs高效递送入多种细菌内发挥抗菌作用。为进一步明确电荷和组氨酸数量对DPP递送效率的影响，我们在DPP7基础上，进一步优化设计5条DPP(DPP8-DPP12)。
1.2DPP/ASOs的制备、表征及稳定性研究
将DPP与ASOs按氮磷比为8∶1的比例混合，37℃孵育，形成DPP/ASOs纳米粒，利用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering，DLS)检测DPP/ASOs粒径；通过检测细菌培养基中DPP/ASOs粒径评价其稳定性；采用荧光分光光度法测定DPP对ASOs的包封率。
1.3DSPE-mPEG2000修饰的DPP/ASOs纳米粒(DP-AD)的制备、表征及稳定性研究
首先，通过流式细胞术测定纳米粒的递送效率和生长曲线法测定纳米粒的抗菌活性来筛选DSPE-mPEG2000的最佳比例，并按此比例制备DP-AD，通过DLS和透射电镜对其表征；通过比较M-H肉汤和水中DP-AD的粒径检测其稳定性。
1.4DP-AD递送效率的筛选评价
以E.coli和A.baumannii为研究对象，采用流式细胞术以细菌阳性率为指标评价细菌对DP-AD的摄取，采用生长曲线法评价DP-ADanti-acpP的体外抗菌活性。
2.DP-AD7向细菌内递送ASOs的抗菌活性研究
2.1不同细菌对DP-AD7的摄取研究
实验菌株为ESBLs-E.coli，MDR-A.baumannii，ESBLs-K.pneumonia，MDR-P.Aeruginosa，MRSA，E.faecalis，耐甲氧西林表皮葡萄球菌和B.subtilis。FAM标记的DP-AD7与细菌共孵育，流式细胞术和激光共聚焦评价细菌的摄取。
2.2DP-AD7anti-acpP的体外抗菌活性
实验菌株选用ESBLs-E.coli和MDR-A.baumannii。通过生长曲线测定DP-AD7对细菌生长的抑制作用，RT-PCR法检测DP-AD7anti-acpP对细菌靶基因表达的抑制效应。
2.3DP-AD7anti-acpP的体内抗菌活性
小鼠腹腔注射cy5标记的DP-AD7后，通过活体成像系统观察DP-AD7在小鼠体内各脏器中的分布。然后，小鼠腹腔注射ESBLs-E.coli构建脓毒症模型，感染后腹腔给予不同治疗，观察小鼠存活率，计数小鼠脏器荷菌量并进行病理学检验。
3.细菌靶向配体Apt-PEG2000-DSPE的设计合成及评价
3.1靶向A.baumannii的适配体优化设计与筛选
首先，合成FAM标记全长适配体(Aci49F和Aci55F)和去掉引物的适配体(Aci49T和Aci55T)，通过流式细胞术测定适配体与细菌的结合率(即细菌的阳性率)，筛选最佳的适配体序列。然后将适配体进行不同的化学修饰后，通过流式细胞法筛选得到亲和力最强的适配体用于后续研究。
3.2适配体稳定性、特异性及亲和力的测定
制备浓度梯度的适配体溶液，分别与细菌共孵育，检测细菌结合率，拟合曲线并得到亲和力常数Kd。然后将适配体与A.baumannii和B.subtilis混合菌液共孵育后，荧光显微镜下观察适配体与细菌结合率，测定适配体对A.baumannii的特异性。将适配体用50%血清或者10U/mLDNA酶处理后，通过琼脂糖凝胶电泳测定适配体的稳定性。
3.3DSPE-PEG2000修饰的适配体(Apt-PEG2000-DSPE)的合成与评价
利用马来酰胺基(-Mal)和巯基(-SH)反应，将适配体与DSPE-PEG2000共价连接得到Apt-PEG2000-DSPE，透析纯化后，1H-NMR进行鉴定。采用流式细胞术和荧光显微镜评价适配体的亲和力和特异性。
4.Apt-DP-AD7的制备表征以及对A.baumannii的靶向性抗菌研究
4.1Apt-DP-AD7中Apt-PEG2000-DSPE比例的筛选及表征
制备DPP7/ASOs纳米粒，然后按照Apt-PEG2000-DSPE与DSPE-mPEG2000不同摩尔比例制备Apt-DP-AD7，并通过DLS和透射电镜进行表征。通过生长曲线法检测不同摩尔比例的Apt-DP-AD7anti-acpP处理对细菌生长的抑制，筛选Apt-PEG2000-DSPE的最佳比例。
4.2Apt-DP-AD7对A.baumannii特异性识别及细菌对Apt-DP-AD的摄取研究
用FAM标记的Apt-DP-AD7与A.baumannii和B.subtilis混合菌液共孵育后，通过荧光显微镜观察Apt-DP-AD7对A.baumannii的特异性。用FAM的Apt-DP-AD7与A.baumannii共孵育后，通过流式细胞术检测细菌对Apt-DP-AD7的摄取率。
4.3Apt-DP-AD7anti-acpP的体内外抗菌活性研究
通过生长曲线和RT-PCR法测定Apt-DP-AD7anti-acpP对MDR-A.baumannii生长和靶基因表达的抑制。通过腹腔感染MDR-A.baumannii构建小鼠脓毒症模型，腹腔给予不同治疗，观察小鼠生存率，并观察小鼠脏器的病理损伤。
结果
1.基于DPP的ASOs递送系统的设计、构建与评价
1.1DPP/ASOs纳米粒表征
DLS结果显示，含有10个或者8个正电荷的DPP7/ASOs，DPP8/ASOs，DPP9/ASOs和DPP11/ASOs的粒径约为120nm，而含有6个正电荷的DPP10/ASOs和DPP12/ASOs的粒径都大于300nm。荧光分光光度法显示，除DPP10和DPP12外，所有DPP对ASOs的包封率约为85%以上。当DPP/ASOs纳米粒用等体积M-H肉汤稀释后，所有纳米粒粒径均显著性增大，提示DPP/ASOs纳米粒在复杂溶液中不稳定。
1.2DSPE-mPEG2000修饰的DPP/ASOs纳米粒(DP-AD)的制备、表征及稳定性研究
流式细胞术筛选结果显示，当DSPE-mPEG2000与ASOs摩尔比例为0.5∶1时，细菌在培养基中对DP-AD7摄取率能达到90%以上，与细菌在水中对DPP7/ASOs的摄取无差异。若DSPE-mPEG2000与ASOs摩尔比例高于或者低于0.5∶1，细菌摄取率都不同程度降低，生长曲线结果进一步证实，该比例的DP-AD7anti-acpP处理ESBLs-E.coli后，细菌生长受到显著抑制，而DSPE-mPEG2000比例增大或减少，均会导致DP-AD7anti-acpP抗菌活性降低。我们采用DSPE-mPEG2000与ASOs摩尔比例为0.5∶1作为制备DP-AD的最佳比例。
按DSPE-mPEG2000与ASOs摩尔比为0.5∶1制备DP-AD，DLS结果显示，含有10个或者8个正电荷的DP-AD7、DP-AD8、DP-AD9和DP-AD11粒径约为120-150nm，zeta电位在25mV至35mV之间，而含有六个正电荷的DP-AD10和DP-AD12粒径都大于350nm，zeta电位约为10mV，提示DPP10和DPP12由于正电荷数量较少，不能与ASOs形成稳定纳米粒。M-H肉汤稀释后，DP-AD7、DP-AD8、DP-AD9和DP-AD11纳米粒粒径与水中粒径相比无显著性差异，提示DP-AD能在M-H肉汤中保持稳定。TEM结果显示，所有DP-AD都呈球形，粒径约为70nm，但DP-AD10和DP-AD12纳米粒之间出现明显粘连，提示正电荷数量对形成稳定的DP-AD起着重要作用。
1.3DP-AD递送效率的筛选评价
流式细胞术检测结果显示，E.coli、S.aureus、A.baumannii分别与序列中含有10个正电荷、2个组氨酸的DP-AD7共孵育后，细菌摄取率均在90%以上；而含有8个正电荷、2个组氨酸的DP-AD8与细菌共孵育后，细菌摄取率均大于90%，但A.baumannii荧光强度相对较低；含有4个组氨酸且正电荷数量分别为10和8的DP-AD11和DP-AD9与细菌共孵育后，细菌摄取率均小于60%；与只含有6个正电荷的DP-AD10和DP-AD12共孵育后，细菌摄取率均低于10%。生长曲线结果证实，仅有DP-AD7anti-acpP和DP-AD8anti-acpP能有效抑制ESBLs-E.coli和A.baumannii的生长，且DP-AD7anti-acpP抗菌活性优于DP-AD8anti-acpP，而同浓度的其余DP-ADanti-acpP纳米粒均无抑制效果。。以上结果提示，含有10个正电荷和2个组氨酸的DP-AD7递送效率最高、抗菌活性最强，故用于下一步研究。
2.ASOs递送系统DP-AD7anti-acpP的体内外抗菌活性研究
2.1不同细菌对DP-AD7的摄取研究
流式细胞术检测结果显示，FAM标记的DP-AD7与细菌共孵育后，所有测试菌的摄取率都在90%以上；激光共聚焦结果进一步证实，DP-AD7可被B.subtilis和ESBLs-E.coli有效摄取。
2.2DP-AD7anti-acpP的体外抗菌活性
DP-AD7anti-acpP处理后，ESBLs-E.coli和A.baumannii生长曲线和RT-PCR结果显示，DP-AD7能够浓度依赖性显著抑制细菌的生长，抑制细菌靶基因的表达。
2.3DP-AD7anti-acpP的体内抗菌活性
活体成像结果表明，腹腔注射2h后，DP-AD7主要分布在小鼠的肝和肾。脓毒症小鼠实验结果显示，感染13h后，模型组小鼠生存率为0%，而给予0.5mg/kg和1.5mg/kgDP-AD7anti-acpP治疗组的小鼠生存率分别达到50%和87.5%，对应错配组小鼠生存率仅为12.5%和37.5%。菌落CFU计数结果显示，DP-AD7anti-acpP可剂量依赖性降低感染小鼠肝肾组织中的荷菌量；HE染色进一步显示，DP-AD7anti-acpP可剂量依赖性减轻感染小鼠肝脏和肾脏的病理损伤。
3.细菌靶向配体Apt-PEG2000-DSPE的设计合成及评价
3.1靶向A.baumannii适配体的设计、合成及筛选
流式结果显示，FAM标记的全长Aci49F和Aci55F以及去掉引物的Aci49T和Aci55T处理后，A.baumannii(ATCC19606)结合率分别为52%、40.5%、57%和30%。提示去掉引物的Aci49T对A.baumannii亲和力最强，作为后续研究的对象。Aci49T经2’-OMe(Aci49T-1)和PS(Aci49T-2)修饰后与A.baumannii共孵育，适配体与细菌结合的结合率分别为40%和60%，提示Aci49T-2与A.baumannii的亲和力最强，作为下一步研究对象。
3.2适配体亲和力、特异性及稳定性的测定
亲和力分析结果显示，Aci49T-2对A.baumannii(ATCC19606)的亲和力常数Kd为0.015μM，适配体与细菌的最大结合率为54%。将Aci49T-2与A.baumannii和B.subtilis混合菌液共孵育后，荧光显微镜下观察发现，A.baumannii显示明显绿色荧光，而B.subtilis几乎没有绿色荧光。提示Aci49T-2保持了对A.baumannii的特异性。用血清和DNA酶处理后，凝胶电泳结果显示，三种化学修饰的适配体的血清稳定性和酶稳定性都明显增加。
3.3Apt-PEG2000-DSPE的鉴定与评价
Apt-PEG2000-DSPE的1H-NMR显示，马来酰氨基特征峰(δ=6.7)消失，而其它峰能与DSPE-PEG2000以及Aci49T-2高度重合，产物成功合成。流式结果显示，Apt-PEG2000-DSPE对A.baumannii的结合率与Aci49T-2保持一致，约50%，说明产物保持了对A.baumannii的亲和力，FAM标记的Apt-PEG2000-DSPE与A.baumannii和B.subtilis混合菌液共孵育后，荧光显微镜观察结果发现，A.baumannii显示明显的绿色荧光，而B.subtilis则没有荧光，说明Apt-PEG2000-DSPE保持了对A.baumannii的特异性。
4.Apt-DP-AD7制备表征以及对A.baumannii的靶向性抗菌研究
4.1Apt-DP-AD7中Apt-PEG2000-DSPE比例的筛选及纳米粒表征
DLS结果显示，不同Apt-PEG2000-DSPE比例的Apt-DP-AD7粒径在110-130nm之间，zeta电位为25mV至35mV之间；TEM结果显示Apt-DP-AD7呈球形，粒径约为70nm。生长曲线结果显示，当Apt-PEG2000-DSPE与DSPE-mPEG2000摩尔比例为1∶2、1∶5或1∶10时，Apt-DP-AD7处理组与对应错配组的细菌生长无显著差异，说明Apt-PEG2000-DSPE比例太高会降低DP-AD7的抗菌活性。当Apt-PEG2000-DSPE与DSPE-mPEG2000摩尔比例为1∶20和1∶40时，与错配组相比，Apt-DP-AD7能显著抑制细菌的生长。为保证Apt-DP-AD的靶向功能，以Apt-PEG2000-DSPE与DSPE-mPEG2000摩尔比例为1∶20制备纳米粒进行下一步研究。
4.2Apt-DP-AD7对A.baumannii特异性识别及细菌对Apt-DP-AD的摄取研究
荧光显微镜观察结果显示，与Apt-DP-AD7共孵育后，A.baumannii有较强绿色荧光，而B.subtilis荧光较弱。说明Apt-DP-AD7保持对A.baumannii的特异性。流式细胞术结果显示，Apt-DP-AD7对ASOs在A.baumannii的递送效率与DP-AD7没有显著性差异。
4.3Apt-DP-AD7anti-acpP的体内外抗菌活性
生长曲线结果显示，Apt-DP-AD7anti-acpP能够显著抑制所有五株敏感和耐药的A.baumannii(ATCC19606、XJ17014279、XJ17014346、XJ17014350和XJ17014362)的生长。同样，RT-PCR结果显示，Apt-DP-AD7anti-acpP能够浓度依赖性抑制所有五株A.baumannii靶基因的表达。动物实验结果显示，模型组小鼠于24h内全部死亡，而给予0.5mg/kg和1.5mg/kgApt-DP-AD7anti-acpP治疗后，小鼠的生存率分别达到了50%和87.5%，给予1.5mg/kgDP-AD7治疗小鼠生存率为62.5%。小鼠脏器HE染色结果显示，Apt-DP-AD7anti-acpP有效降低肝肾肺组织损伤，显示明显的动物保护效应。
结论
1.两亲性DPP作为ASOs细菌内递送载体设计的理想要求：正电荷数量为8-10个；组氨酸数量为2个。
2.以DPP7包裹ASOs为内核，以DSPE-PEG为外壳构建的DP-AD7，是一种新型的体内外均有效的ASOs抗菌分子递送系统。
3.Aci49T-2适配体修饰的DP-AD7(Apt-DP-AD7)，能靶向识别A.baumannii，提高DP-AD7anti-acpP的抗菌活性，为ASOs细菌靶向递送提供新策略。