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我们知道神经系统支配人体的各个系统和器官并对其功能进行相应的调节。从骨组织中发现神经纤维到一系列神经功能改变可以导致骨组织异常的发现均是确凿的证据,但临床中发现骨折病人若同时伴有脑外伤,其骨折愈合过程明显加快,甚至在未见骨折的一些关节周围出现异位骨化的现象仍然引起了极大的关注。是什么机制导致了这种现象的发生至今仍然不明确。很多学者基于各自的研究提出了多种假设,但均没有得到广泛的认可。脑外伤后是否导致脑组织内某些成份释放入血液系统,而其中又有促进骨折愈合的因子呢?不少学者针对血液循环中的生长因子等展开了相关研究均没有取得突破。新近的研究表明交感神经是瘦素依赖的中枢神经系统调节骨代谢的关键环节之一,而骨细胞系中广泛存在肾上腺素能受体可能起到相应的信息传递作用。以上发现为该研究领域提供了新的思路和途径。我们的前期研究发现：大鼠脑组织中灰质和白质能显著促进成骨细胞增殖和分化,尤以灰质的促进作用为最强烈。大鼠脑灰质提取液也能显著地刺激原代骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs)和二代以后的BMSCs增殖及向成骨细胞分化。脑外伤合并骨折患者的血浆较单纯骨折和单纯脑外伤患者血浆对成骨细胞增殖有更明显的促进作用。那么,脑灰质对成骨细胞的促进增殖作用是否可以跨种属普遍存在呢?脑灰质的浓度是否和促进成骨细胞的增殖和分化程度存在什么关系?脑组织促进成骨作用和骨系细胞中的肾上腺素能受体调节骨重建机制之间又存在什么联系?为解答上述疑问展开本实验的研究。目的探讨脑灰质促进成骨细胞增殖的跨种属现象,分析脑灰质促进成骨作用的剂量效果关系,然后研究肾上腺素受体在脑灰质促进成骨中的作用。方法研究分以下几个部分进行：1、制作大鼠脑灰质提取液,分别用10% NCS-MEM培养液进行1000倍、100倍和10倍稀释配制成工作液,用不同浓度工作液培养新生SD大鼠成骨细胞,比较各种[作液浓度对成骨细胞增殖和ALP (Alkaline Phosphatase,碱性磷酸酶)合成的剂量-效果关系。2、提取猪大脑灰质、白质、垂体、肌肉组织,同时提取大鼠大脑灰质、白质、垂体、肌肉,分别制成匀浆提取液,将稀释100倍的提取液用于培养大鼠成骨细胞,比较研究各种组织提取液对成骨细胞增殖影响的差异。3、提取大鼠脑灰质制成脑灰质提取液,用稀释100倍的提取液培养成骨细胞,培养液中分别加入普奈洛尔和酚妥拉明,在实验第1、4和7天分别用MTT法检测成骨细胞的增殖,同时间点用PNPP法检测ALP的含量以评估成骨细胞的分化。4、分离大鼠原代骨髓基质细胞,将脑灰质提取液(稀释100倍)、普奈洛尔(1uM)、酚妥拉明(1uM)和肾上腺素(0.1uM)分别和联合培养骨髓基质细胞,24小时后用实时荧光RT-PCR检测RUNX2 (Runt-related Gene 2,侏儒相关基因2)、ALP、骨钙素、RANKL (Ligand of Receptor Activator of NF-kB,核激活因子受体配体)和OPG (osteoprotegerin,骨保护素)mRNA的表达量,比较不同组之间mRNA表达的差别。结果1、大鼠脑灰质促进成骨细胞增殖和分化的剂量-效果关系1)在脑灰质促进成骨细胞增殖方面,稀释1000倍的脑灰质提取液MTT值和对照组之间没有显著差别(P>0.05)。稀释100倍和10倍的脑灰质提取液MTT值对照组之间有显著差异(P<0.01)。各组组间ANOVA Turkey分析显示稀释1000倍、100倍和10倍三组之间存在显著差异,提示脑灰质提取液促进成骨细胞的增殖作用和提取液的浓度有关,根据曲线趋势可以认为脑/灰质提取液在本实验浓度范围内促进增殖趋势和浓度呈正相关。2)在脑灰质提取液对成骨细胞合成ALP的影响方面,PNPP法检测ALP含量在稀释1000倍的脑灰质提取液作用组和对照组之间存在显著差异(P<0.01)。稀释10倍和10倍的脑灰质提取液ALP含量和对照组之间也有显著差异(P<0.01)。而目ANOVA turkey分析显示该4组数据相互之间也存在显著差异(P<0.05)。结果提示不同浓度的脑灰质提取液均可促进成骨细胞的分化,而且根据实验的趋势曲线可以看到这种促进分化的作用和脑灰质提取液的浓度呈正相关。2、猪和大鼠的脑/灰质提取液具有最显著促进成骨细胞增殖的能力(P<0.05),两者对成骨细胞的促增殖能力没有显著差异(P>0.05)。和空白对照相比,脑组织的各种提取液均显著促进了成骨细胞的增殖(P<0.05),而且异种属和同种属的相应脑组织成分对成骨细胞的增殖能力没有显著差别(P>0.05)。3、α和β肾上腺素受体阻滞剂对成骨细胞增殖和分化的影响。1)当单独往成骨细胞培养体系中加入1uM普奈洛尔、luM酚妥拉明时,普奈洛尔和酚妥拉明组在第1、4和第7天的成骨细胞增殖(MTT值)和对照组之间没有显著差别(P>0.05)。2)当单独往成骨细胞培养体系中加入1uM普奈洛尔、1uM酚妥拉明时,普奈洛尔和酚妥拉明组在第1、4和第7天的ALP含量和对照组之间没有显著差别(P>0.05)。3)和单纯脑灰质提取液培养组相比,往培养液中加入普奈洛尔或酚妥拉明均不能显著改变成骨细胞在第1、4和7天的MTT值。4)和单纯脑灰质提取液培养组相比,往培养液中加入酚妥拉明不能显著改变成骨细胞在第1、4和7天的ALP含量。往培养液中加入普奈洛尔在第1和4天的ALP含量和单纯脑灰质提取液培养组没有显著差别。在第7天时普奈洛尔组的ALP含量显著低于单纯脑灰质提取液培养组。4.α和β肾上腺素受体功能对骨髓基质细胞骨相关基因(RUNX2、ALP、骨钙素、RANKL和骨保护素)mRNA转录的影响1)脑灰质提取液增加了骨髓基质细胞的骨钙素mRNA的转录,但是不影响RUNX2 mRNA、ALP mRNA转录和RANKL/OPGmRNA比值。2)肾上腺素降低了骨髓基质细胞RANKL/OPG转录比值,但不影响RUNX2、ALP和骨钙素mRNA的转录。3)普奈洛尔不影响骨髓基质细胞RUNX2、ALP和骨钙素mRNA的转录和RANKL/OPG转录比值。4)酚妥拉明显著增加了骨髓基质细胞骨钙素mRNA的表达,但对RUNX2、ALP mRNA的转录和RANKL/OPG转录比值没有显著影响。5)脑灰质+肾上腺素联合作用显著增加了RUNX2、ALP和骨钙素mRNA的转录,而且RUNX2和ALP mRNA的转录量较单独脑灰质组增加也有显著意义。但是脑灰质十肾上腺素联合作用不影响RANKL/OPG转录比值。6)脑灰质+普奈洛尔显著增加了骨钙素mRNA的转录,但是对RUNX2和ALP mRNA转录和RANKL/OPG转录比值没有影响。7)肾上腺素可以通过β受体协同脑灰质提取液增加骨髓基质细胞RUNX2和ALP mRNA的转录。而骨钙素mRNA的转录增加是由于脑灰质的刺激作用导致,而且肾上腺素不影响RANKL/OPG转录比值。而肾上腺素也可以通过α受体协同增加RUNX2和ALP mRNA的转录,同样两者的联合作用不影响RANKL/OPG转录比值。结论1.脑灰质促进成骨细胞增殖和分化作用呈剂量依赖性,以稀释100倍的脑灰质提取物进行成骨细胞实验是合适的。2.猪脑组织能跨种属促进大鼠成骨细胞的增殖,其中以脑灰质的促进作用最为显著。提示脑内固有成分促进成骨细胞增殖的机制具有普遍性。3.α和β肾上腺素受体阻滞剂均不会直接影响成骨细胞的增殖和分化。脑灰质促进成骨细胞增殖的过程不通过a肾上腺素受体途径,而β受体可能间接参与了脑灰质促进成骨细胞分化的过程。4.脑灰质提取液和a、β肾上腺素能受体均可参与骨髓基质细胞骨相关基因转录的调节。脑灰质提取液促进骨髓基质细胞增殖和成骨分化的作用和α、β肾上腺素能受体信号通路有关,具体信号传导和作用机制需要进一步研究。