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目的:人脐带间充质干细胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,h UCMSCs)作为一种较新型的MSCs,其移植对于各类损伤的组织器官有良好的修复作用,因此也成为干细胞研究领域的热点之一。但研究发现,h UCMSCs移植后会受到机体内环境的影响,生物学特性发生改变,进而影响其修复效果。那么,如何能够处理h UCMSCs,使其更适应机体内环境,发挥更好的组织修复作用是近来的研究热点,也是本研究的重点。损伤组织局部微环境中RAS系统的激活致使血管紧张素-Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ,Ang-Ⅱ)持续生成,影响着内、外源性MSCs的生物学活性及功能。有研究表明,高浓度Ang-Ⅱ可诱导MSCs、人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelia cells,HUVEC)等多种细胞发生损伤、凋亡、甚至死亡,而低浓度Ang-Ⅱ预处理MSCs后,则可显著提高其耐缺氧能力,促进多种细胞因子的分泌。在旁分泌的多种细胞因子中,血管内皮细胞因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是含量较高且发挥修复治疗作用的关键因子,其通过与特异性受体(VEGFR2)结合,激活下游信号而发挥抗细胞凋亡、促细胞增殖以及新生血管生成的作用,进而修复重建各类损伤的组织器官。在前期实验和查阅文献的基础上,本研究拟通过使用适宜浓度Ang-Ⅱ预处理体外培养的h UCMSCs,再将预处理后的h UCMSCs(Ang-Ⅱ-MSCs)移植于全层皮肤缺损动物模型,观察其对创面修复重建的效果,以及深入研究Ang-Ⅱ-MSCs促创面愈合的机制。从而为干细胞用于临床治疗多种创面提供的研究基础。方法:(1)Ang-Ⅱ对h UCMSCs生物学特性的影响:将培养的h UCMSCs随机分为4组:0ng/m L Ang-Ⅱ组(A组)、100ng/m L Ang-Ⅱ组(B组)、500ng/m L Ang-Ⅱ组(C组)和1000ng/m L Ang-Ⅱ组(D组)。倒置相差显微镜观察细胞的形态和生长融合的情况;CCK8法检测细胞的增殖情况;AO-EB染色法检测细胞的凋亡情况;流式细胞仪检测细胞的增殖周期和细胞的凋亡率。ELISA检测上清液中VEGF、b FGF和HGF的含量。(2)Ang-Ⅱ预处理的h UCMSCs(Ang-Ⅱ-MSCs)促进创面愈合的初步探索:实验分为3组:将18-20kg雄性巴马小型猪背部切取三个5cm×5cm大小的正方形的创面,制备全层皮肤组织缺损模型。选取创面的9个点,通过局部注射的方式分别含有Ang-Ⅱ-MSCs(1×107/1 m L ECM)、MSCs(1×107/1 m L ECM)Control(1m L ECM)的1ml培养基注入相应全层皮肤缺损模型创面。Image Pro Plus软件评估各组创面的愈合率,记录创面的愈合时间。组织化学染色检测各组创面组织的整体结构、新生微血管的数量、胶原的排列情况以及角质蛋白K19(CK19)的表达情况。(3)Ang-Ⅱ预处理后h UCMSCs的上清液(Ang-Ⅱ-CM)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、凋亡及血管形成的影响机制研究:首先将培养的HUVEC分为3组:培养基组(CM)、MSCs条件培养基组(MSCs-CM)、100ng/m L Ang-Ⅱ预处理后MSCs条件培养基组(Ang-Ⅱ-CM),研究Ang-Ⅱ-CM对HUVEC的增殖、凋亡的影响。选用1000ng/m L Ang-Ⅱ致HUVEC损伤,制备凋亡模型。倒置相差显微镜观察各组细胞的形态;CCK8法检测各组细胞的增殖情况;AO-EB、Hoechst染色法、流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况;Western Blot检测各组细胞Caspase-3、bcl-2的表达情况,体外血管生成实验检测各组细胞血管形成能力。在Ang-Ⅱ-CM对HUVEC的增殖、凋亡影响研究结果的基础上,深入探讨h UCMSCs旁分泌的VEGF对HUVEC的保护机制,本实验继续分为以下6组:si RNA-Control+CM、si RNA-Control+MSCs-CM、si RNA-Control+Ang-Ⅱ-CM、si VEGFR2+CM、si VEGFR2+MSCs-CM、si VEGFR2+Ang-Ⅱ-CM。流式细胞仪检测细胞的凋亡率;Western Blot检测Caspase-3、bcl-2的表达情况;体外血管生成实验检测细胞的血管形成情况。结果:(1)Ang-Ⅱ对h UCMSCs生物学特性的影响:与0 ng/m L组相比,500 ng/m L组和1000 ng/m L组中h UCMSCs的形态结构均发生改变,凋亡细胞的数目较多,增殖活性较低,上清中细胞因子水平也均较低,且1000 ng/m L组最为显著。而100ng/m L组h UCMSCs形态和结构均正常,未见凋亡细胞或死亡细胞,且100ng/m L组细胞的增殖活性和分泌的细胞因子均显著高于0 ng/m L组、500 ng/m L组和1000 ng/m L组。因此,我们筛选100ng/m L Ang-Ⅱ进行预处理h UCMSCs。(2)Ang-Ⅱ预处理的h UCMSCs(Ang-Ⅱ-MSCs)促进创面愈合的初步探索:在Control组、MSCs组和Ang-Ⅱ-MSCs组中,Control组创面的愈合效果最差,Ang-Ⅱ-MSCs组最好。三组创面的愈合时间分别为:55±3d、47±3d和40±3d,Ang-Ⅱ-MSCs组创面的愈合时间最短。在35d时,三组创面的愈合率分别为(63±4)%、(75±4)%和(88±5)%,Ang-Ⅱ-MSCs组创面的愈合率最高,且该组创面组织的结构较完整,新生微血管数量较多、胶原排列更规整以及上皮化的程度更佳。(3)Ang-Ⅱ预处理后的h UCMSCs上清液(Ang-Ⅱ-CM)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、凋亡、新生血管影响的机制研究:Ang-Ⅱ-CM对HUVEC增殖、凋亡、新生血管影响的研究结果表明,与CM组相比,Ang-Ⅱ-CM组与MSCs-CM组中HUVEC的形态和结构均较好,其中Ang-Ⅱ-CM组凋亡细胞或死亡细胞最少,血管形成数量和细胞的增殖活性最好,MSCs-CM组次之。两组抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平均较CM组高,促凋亡蛋白Caspase-3的表达水平也较CM组低,而Ang-Ⅱ-CM组则更为显著。进一步使用si RNA干扰HUVEC中VEGFR2后,结果显示:与si RNA-Control组相比,si VEGFR2组中Bcl-2表达量降低,Caspase-3表达量增高。此外,si VEGFR2组中凋亡细胞数量也较si RNA-Control组显著增加,而新生微血管的数量则显著减少。因此,VEGF和VEGFR2以及下游调控的Caspase-3和Bcl-2信号是h UCMSCs发挥促内皮细胞增殖、抗内皮细胞凋亡以及促内皮新生微血管的潜在机制。结论:综上所述,适宜浓度(100ng/m L)Ang-Ⅱ预处理的h UCMSCs可促进其的增殖、减少凋亡,通过旁分泌高水平的VEGF,与内皮细胞上的VEGFR2结合,抑制下游的促凋亡蛋白Caspase-3和增加抗凋亡蛋白Bc-2的表达,发挥进促内皮细胞存活、增殖和抗内皮细胞凋亡能的作用,进而显著促进了猪全层皮肤缺损性创面的愈合。