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研究背景与目的:骨肉瘤(osteosarcoma)是最常见的骨恶性肿瘤,肺转移是其致死的重要原因。研究表明,细胞失巢凋亡抵抗是促进肿瘤转移的重要因素,但是,失巢凋亡抵抗促进骨肉瘤肺转移的机制尚不明确。我们前期实验研究显示,FASN在骨肉瘤合并肺转移患者中高表达。在本研究中,我们探索FASN在骨肉瘤失巢凋亡抵抗促进肺转移的作用及其分子机制。研究方法:1、骨肉瘤细胞(143B、MG-63、Saos-2)与正常成骨细胞(hFOB1.19)抗失巢凋亡能力的研究:采用台盼蓝细胞染色检测细胞失巢状态下的存活率,采用克隆形成实验检测细胞失巢后克隆形成能力,采用流式细胞术检测细胞失巢凋亡率,比较骨肉瘤及正常成骨细胞的失巢凋亡抵抗能力。2、FASN在骨肉瘤细胞抗失巢凋亡中的作用:在骨肉瘤细胞(143B、MG-63、Saos-2)与正常成骨细胞(hFOB1.19)中,采用Western-blot、qPCR、ICC检测FASN及pERK1/2、Bcl-xl表达水平。探索FASN/pERK1/2/Bcl-xl分子信号通路在骨肉瘤细胞失巢凋亡中的作用。3、改变FASN表达,验证FASN在失巢凋亡抵抗中的作用及机制:在FASN高表达细胞中下调FASN表达,在FASN低表达细胞中,上调FASN表达,检测细胞迁移、克隆形成率、细胞失巢凋亡率验证FASN促进失巢凋亡抵抗。Western-blot检测FASN/pERK1/2/Bcl-xl表达水平。我们对FASN-overexpression组进行了信号通路阻断试验。FASN-overexpression和control细胞中,使用MEK抑制剂GDC-0973阻断p-ERK1/2表达,检测下游BCL-xl表达及失巢凋亡率。4、建立失巢凋亡抵抗细胞株进一步验证FASN参与失巢凋亡抵抗:采用反复多次悬浮-贴壁的方法建立失巢凋亡抵抗细胞株143B-AR。检测143B-AR细胞失巢凋亡抵抗能力及FASN/pERK1/2/Bcl-xl表达水中。5、体内实验。裸鼠皮下成瘤后进行原位移植,比较143B-AR和143B细胞成瘤能力。活体注射下调FASN的慢病毒观察抑制FASN对成瘤能力及肺转移的影响。研究结果:1、骨肉瘤细胞抗失巢凋亡能力明显高于正常成骨细胞:悬浮培养后骨肉瘤细胞143B、MG-63失巢存活率、克隆形成数目显著高于非肿瘤细胞hFOB 1.19,而细胞凋亡率显著低于hFOB 1.19。2、FASN的表达水平与失巢凋亡抵抗呈正相关。FASN在143B、MG-63细胞中高表达,在Saos-2、hFOB1.19细胞中低表达。在蛋白水平上,FASN与pERK1/2/Bcl-xl的表达水平一致。3、下调FASN降低143B、MG-63细胞失巢存活率及迁移能力,增加失巢凋亡率,抑制pERK1/2/Bcl-xl通路。上调FASN增加Saos-2、hFOB1.19细胞失巢凋亡存活率及迁移能力,激活pERK1/2/Bcl-xl通路。并且,阻断pERK无法完全逆转上调FASN所致的失巢凋亡抵抗作用。4、143B-AR细胞具有失巢凋亡抵抗能力。与143B细胞相比,143B-AR细胞具有更高失巢存活率及迁移能力,失巢凋亡率更低,FASN/pERK1/2/Bcl-xl通路激活。抑制FASN可降低其失巢凋亡抵抗能力。5、体内实验验证FASN促进骨肉瘤细胞成瘤及转移。143B-AR细胞具有更强的体内成瘤能力,下调FASN抑制143B-AR细胞肺转移。结论:本研究中,我们明确了FASN在介导失巢凋亡抵抗促进骨肉瘤细胞肺转移明确中的作用,初步探索了骨肉瘤肺转移相关的分子机制,为今后骨肉瘤临床治疗提供新的治疗靶点。