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[背景] 原发性肝癌(Primarylivercancer,PLC)是世界上第五大恶性肿瘤,近年来其发病率有逐年增加的趋势[1]。肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要类型,占90％以上。HCC的主要治疗手段仍然是为手术治疗,然而术后复发率高达80%,即使小肝癌也高达43.5%,5年无瘤生存率仅为10%-30%[2]。肝癌细胞大多对放、化疗的不敏感,是影响肝癌整体疗效的重要因素。对肝癌术后易于复发及对放化疗耐受的细胞和分子生物学机制的研究,一直没有很大的突破,也始终是肝癌研究的难点与热点。 近年来,随着肿瘤干细胞(CancerStemCell,CSC)学说的提出,为肝癌高复发率及对放化疗耐受的分子细胞学机制提供了新的研究思路。CSC学说认为,肿瘤细胞是由大量的有限增殖成熟细胞和一小部分无限增殖的干细胞组成的,虽然前者可被手术切除或放化疗所杀灭,但只要剩下极小部分CSC,仍然可形成新的肿瘤组织。因此,CSC是肿瘤术后转移、复发和对放化疗耐受的基础。 对肝癌干细胞的研究进展,国内外目前处于起始阶段,如何筛选分离出肝癌CSC,并进行特征鉴定,是目前的难点。利用细胞表面标记物筛选法和无血清悬浮培养+侧群细胞筛选法是目前获取肝癌CSC的主要,但均都存在或多或少的缺陷。本研究利用肝癌对化疗耐药的特性,采用5-Fu富集肝癌CSC,并进一步分离和鉴定,探讨肝癌CSC的筛选方法及其生物学特性。 [目标] 1建立富集肝癌干细胞的方法,解决肝癌干细胞研究中因癌干细胞数量少所致的瓶颈问题。 2低剂量5-Fu反复作用肝癌细胞株后,研究残余细胞干细胞样生物学特性。 [方法] 围绕上述目标,本研究主要研究方法如下: 1对低剂量5-Fu相对耐药的肝癌PLC/RAF/5/5-Fu细胞株诱导获得 采用低浓度的5-Fu(1ug/mL)反复作用于肝癌PLC/RAF/5细胞株,当细胞能在含1ug/mL5-Fu的培养液中存活时,即为人肝癌PLC/RAF/5/5-Fu细胞株;显微镜下观察两种细胞形态学;用CCK-8检测两种细胞对5-Fu的耐药性。 2肝癌细胞株PLC/RAF/5、PLC/RAF/5/5-Fu的体外实验 细胞周期的检测;细胞凋亡检测;Transwell细胞迁移实验及细胞划痕实验检测迁移能力;平板克隆集落实验检测增殖能力;WesternBlot检测Bax、Bcl-2、FoxM1、ABCG2蛋白。 3侧群细胞的检测 分别检测SP细胞在PLC/RAF/5/5-Fu细胞株与PLC/RAF/5细胞株中的含量。 [结果] 11ug/mL低浓度5-Fu反复作用于PLC/RAF/5细胞株后,得到的PLC/RAF/5/5-Fu细胞株形态发生改变,与亲本细胞相比,PLC/RAF/5/5-Fu细胞棱角减少,呈长梭形样改变,胞浆清亮、折光性增强,细胞呈片状生长,细胞传代时的消化时间明显缩短,不易吹打成单细胞悬液,且单个细胞的形态多不规则,和亲本细胞株之间存在显著差异;且CCK8实验表明:PLC/RAF/5/5-Fu细胞对5-Fu的相对抑制率低于亲本细胞,表明PLC/RAF/5/5-Fu对低浓度的5-Fu具有一定的耐药性。 2PLC/RAF/5/5-Fu细胞和PLC/RAF/5细胞相比: 2.1PLC/RAF/5细胞细胞周期G0/G1期细胞分布比率低于亲本细胞株,而S期和G2/M期细胞分布比率明显高于亲本细胞株,差异具有统计学意义(n=3,p<0.05)。 2.2在0.5ug/ml、1ug/ml、2ug/ml的5-Fu作用下,PLC/RAF/5和PLC/RAF/5/5-Fu细胞AnnexinV+细胞比列分别为:(4±1.25)%、(11.24±2.64)%、(27.48±2.16)%和(3.21±0.65)%、(3.6±0.83)%、(5.42±1.2)%,表明PLC/RAF/5/5-Fu细胞抗凋亡能力强。 2.3细胞划痕实验及Transwell细胞迁移实验表明:PLC/RAF/5/5-Fu细胞比PLC/RAF/5细胞迁移能力强。 2.4平板克隆集落实验提示:与PLC/RAF/5细胞相比,PLC/RAF/5/5-Fu细胞形成的克隆较密集且直径较大,其CFA为(26.01±3.42)%,而PLC/RAF/5/5-Fu细胞的CFA为(35.83±4.51)%,二者有统计学意义(N=3,P<0.05)。 2.5Westernblot表明PLC/RAF/5/5-Fu细胞的Bax、Bcl-2、ABCG2和FoxM1蛋白的表达量明显增加。 以上结果均表明PLC/RAF/5/5-Fu细胞的生物学特性与CSCs相似。 3PLC/RAF/5细胞中SP细胞比例显著高于用Verapamil阻断后的对照组(3.3±1.2)%vs(0.0±0.0)%,P<0.01;PLC/RAF/5/5-Fu细胞中SP细胞的比例亦显著高于对照组(22.6±1.8)%vs(4.1±1.6)%,P<0.01,表明5-Fu筛选可以富集SP细胞。 [结论] 1低浓度5-Fu反复作用于PLC/RAF/5细胞株后,可以得到耐药的细胞株PLC/RAF/5/5-Fu,其抗凋亡能力、迁移能力、克隆形成能力以及与CSCs相关的蛋白表达水平皆增加,符合CSCs的生物学特性,且SP细胞的含量增加; 2低剂量5-Fu可以富集PLC/RAF/5细胞株中肝癌干细胞样细胞的含量。