研究背景食管癌(esophageal cancer,EC)是来源于食管上皮组织的消化道恶性肿瘤,食管癌在全球癌症中发病率居第8位,死亡率居第6位,严重威胁着全人类的健康和生命。食管癌的发病具有明显的地理聚集特性,我国是该病的高发地区之一,也是世界上食管癌发病率和死亡率最高的国家之一。因此,我国将食管癌列为目前重点防治的恶性肿瘤之一。在病理组织类型上,食管癌以鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)和腺癌(adenocarcinoma, ADC)两种病理类型为主,我国食管癌则以食管鳞癌为主。在发病部位上,食管癌好发于食管下段,中段次之,上段较少。食管癌起病隐匿,早期仅为暖气、反酸等非特异性且轻微症状,很多患者常在出现吞咽困难或食道梗阻、声嘶、呛咳和明显的胸背疼痛等症状的时候才就诊,此时疾病多已进展至中晚期,预后不佳。早期食管癌手术切除后生存率可达70%以上,然而中晚期患者单纯手术治疗后5年生存率仅为10%-20%。结合食管癌的NCCN指南,目前国际上普遍认为,对于中晚期食管癌的治疗,应结合其发病的部位不同,以外科手术、放疗和化疗联合运用的综合治疗方式。中晚期食管癌患者吞咽困难、声嘶等症状明显,也严重影响了患者的生活质量。因此,促进食管癌的早期诊断和早期治疗是防治食管癌工作的重中之重。然而,目前对食管癌的诊断主要依靠影像学和组织学检查,缺乏特异的食管癌肿瘤标志物。因此,为食管癌寻找特异性肿瘤标记物,从分子水平提高其早期诊断率、评估预后、判断治疗效果成为了近年来研究的一大热点。1954年发现的蛋白激酶CK2(casein kinase2),又被称为酪蛋白激酶2。蛋白激酶CK2是一种高度保守的,在真核细胞中普遍存在的丝/苏氨酸蛋白激酶,它可以不依赖第二信使而发挥生物学功能。蛋白激酶CK2可以分布于细胞核和/或细胞浆之中,由两个催化亚基α和/或α’(35-44kD)及两个调节亚基β(24-29kD)构成的不均一四聚体,其全酶形式包括ααββ、α’α’ββ、αα’ββ三种,其游离的α亚基在自然状态下也存在。此外,CK2的活性在自然状态下是持续激活的,但其活性可以在有亚精胺(镁离子Mg2+存在下)和多聚赖氨酸(锰离子Mn2+存在下)的情况下进一步升高,并且它缺乏获得性功能的突变。α亚基的主要功能是通过识别功能蛋白并将其磷酸化,同时它也可以作为一个癌基因；β亚基的功能目前尚未明确,主要认为它在维持α亚基及蛋白激酶CK2全酶的稳定性、促进CK2入核以及直接募集底物等方面发挥着重要的生物学作用。由于蛋白激酶CK2的底物约有3000多种,因此它可以通过对不同底物的磷酸化,参与多种生理病理的过程,包括DNA的复制与转录、RNA的加工及翻译、细胞增殖与分化、癌基因与抑癌基因的调节和信号传导通路等。正是因为蛋白激酶CK2这样的特异性,研究发现它与多种疾病密切相关,包括了脑神经退行性病变(如阿尔兹海默病)、自身免疫性疾病(如肾小球肾炎)、血管相关疾病、病毒及寄生虫感染和各种恶性肿瘤(如头颈部鳞癌、肺癌、胃癌、结直肠癌、子宫内膜癌、前列腺癌和血液系统肿瘤等)。许多研究都表明,蛋白激酶CK2与恶性肿瘤的发生发展关系密切。根据目前的研究进展,我们认为CK2调控肿瘤主要通过对原癌基因的激活、或者通过抑制抑癌基因的活性两个方面或途径,进而通过相关的信号通路并最终达到促进肿瘤发生发展的目的。一方面,在许多恶性肿瘤中都可以发现癌基因的激活。蛋白激酶CK2可以通过激活某些致癌因子,比如蛋白激酶CK2可以磷酸化IkB,促进核因子NF-kB的入核,激活NF-kB的基因转录功能；CK2也可以磷酸化p65,促进NF-kB与目的基因的靶定。又比如,蛋白激酶CK2可以激活和稳定体内WNT—β-catenin通路,并减少肿瘤细胞的凋亡,促进迁移侵袭。蛋白激酶CK2还可以影响PI3K-AKT通路,促进肿瘤的发生。另一方面,CK2还可以作用于一些抑癌因子。首先,蛋白激酶CK2可以通过诱导蛋白酶第517位丝氨酸的磷酸化,以促使早幼粒白血病细胞蛋白PML的降解,进而促进白血病的发生。其次,蛋白激酶CK2也可以通过连接蛋白connexin进而调控肿瘤的发生,通过免疫共沉淀实验发现,“第10号染色体缺失的磷酸酶基因、与张力蛋白和辅助蛋白同源的基因’’PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome10)与CK2直接结合,并致使PTEN的C端残基的磷酸化,导致PTEN的降解,进而影响肿瘤相关的PI3K-AKT通路,并最终促进了白血病细胞的存活。第四,蛋白激酶CK2可以通过对p53的磷酸化促进突变的p53降解。综上所述,蛋白激酶CK2可以通过多种途径降低肿瘤细胞的凋亡率,促进肿瘤细胞的迁移侵袭,在恶性肿瘤的发生、进展和转移过程中都发挥着不同的生物学功能作用。研究目的鉴于当前的研究进展,CK2α或CK2β基因及蛋白在多种肿瘤中的表达水平,相较于周围正常组织都明显升高,然而目前在食管癌与蛋白激酶CK2β的相关性尚未见报道。因此我们希望能通过对食管癌组织及食管正常中CK2β基因及其蛋白的表达水平,探讨CK2β与食管癌的发病及预后的关系,以期为蛋白激酶CK2β在食管癌发生发展过程中的机制的深入研究和分子靶向治疗的开展提供理论及实验依据。研究方法1、采用免疫组化IHC方法检测含60对食管癌及其周围正常的组织芯片中CK2β的表达水平；2、进一步利用统计学方法,对组织芯片的染色结果与相关病历资料进行病理学参数的相关分析,找出CK2p与食管癌诊断、预后之间的关系；3、同时,收集南方医院胸外科2012年2-4月期间手术切除的食管组织标本10例,并提取其组织的蛋白和RNA,再利用Western Blot和实时荧光定量PCR的实验方法检测其CK2β的表达水平变化。实验结果1、病理组织学评价1.1蛋白激酶CK2β在食管癌及其周围正常组织中的表达情况在食管癌组织中,CK2p表达阳性,染色呈黄色或黄褐色,散在分布于胞核和胞浆中,颗粒状。组织芯片免疫组化结果显示,CK2p在食管癌组织中普遍高表达：在56例癌组织中,50例(85.71%)表达强阳性,7例(10.71%)表达中阳性,1例(1.79%)表达弱阳性,2例(1.79%)表达阴性；而在其相对应的正常组织中,则以阴性表达为主：仅有2例(3.33%)表达弱阳性,余表达均为阴性。以上结果显示,CK2β在食管癌及正常组织中阳性表达的分布有显著差异(p<0.001)。1.2蛋白激酶CK2p的表达水平与食管癌的病理参数之间的关系进一步运用统计学方法进行分析,我们发现,CK2p蛋白在食管癌中的表达水平,与患者年龄、性别、T分期,淋巴结转移与否均无统计意义,但与TNM分期显著相关,p值为0.010。2、Western Blot结果收集本院手术切除的初治食管癌患者的食管癌组织及其周围正常组织,将10例本院手术切除食管组织提取蛋白,进行Western Blot实验。接着将Western blot结果结合pro-gel analyzer软件进行灰度值分析：与其周围正常组织相比,食管癌组织中的蛋白激酶CK2β的表达水平明显升高。3、实时荧光定量PCR反应结果分别提取8例本院手术切除食管组织的RNA后,进行逆转录反应及实时荧光定量PCR,并对结果进行数据分析：8对食管组织中有6对(75%)食管癌的CK2p的表达水平要明显高于其周围正常组织。结论一、蛋白激酶CK2β在食管癌组织及其周围正常组织中均有不同程度表达,但在食管鳞状细胞癌组织中的CK2β的表达阳性率明显高于正常粘膜组织,提示CK2p可能可以作为一个食管癌诊断的肿瘤标志物；二、蛋白激酶CK2p蛋白在食管癌组织中的表达水平与患者年龄、性别、T分期,是否有淋巴结转移均无统计意义,但与TNM分期显著相关,提示CK2p可能可以作为一个判断肿瘤治疗效果及判断预后的分子指标。三、蛋白激酶CK2p在手术切除食管癌患者的肿瘤组织及其正常组织间的基因表达和蛋白表达均有显著的差异。鉴于此,通过病理检测食管鳞状细胞癌患者的肿瘤组织中CK2p基因的表达情况,对于诊断食管鳞癌患者疾病的发生和进展、评估其治疗效果及判断预后都存在着重要的临床意义,这也揭示了CK2p基因具有的潜在的分子生物学意义。结果说明,CK2β基因可能成为一个诊断食管癌的新的分子指标,并为抗肿瘤的治疗提供新的治疗靶点。