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家蚕(Bombyx mori)是重要的经济昆虫和鳞翅目的代表性种类,性染色体为ZW型,W染色体上显性的Fem基因(feminizing gene)决定家蚕的性别。家蚕性别决定的分子机制尚未完全阐明,而剂量补偿存在与否也并未定论。
本研究通过文库筛选和RACE的方法,在家蚕中克隆到9个与果蝇性别决定级联通路同源的基因,其中包括五个msl(male-specific lethal)基因,对其开展了初步的功能研究。通过数据发掘和系统发生分析,发现msls基因和其副本广泛地存在于从昆虫到哺乳动物的多种动物中,但五个msl基因由基因复制在不同的时期演化产生,未表现出协同的效应。利用实时定量RT-PCR研究了十个与家蚕Z染色体连锁的基因在雌雄间的表达,发现一部分基因在雌性高表达,而另一部分为雄性高表达,没有明显的补偿现象,暗示家蚕msl基因的功能可能与果蝇不同。而其中一些转录因子除了负责调控果蝇Sxl(Sex-lethal)表达外,还参与了包括体节分节等其它发育过程。
本研究在研究家蚕性别决定同源基因的功能时,没有发现Bmgro和Bmrunt等基因对家蚕性别决定的显著调控作用,但发现其与主要胚胎发育中的体节分节有关。成对规则基因(pair-rule genes)仅在交互式的体节上表达,在果蝇体节分节中占据重要位置,能将上游基因宽泛的浓度梯度转化为双体节周期性表达。但在昆虫中成对规则基因的同源基因其表达图式和功能都有较大的多样性。
家蚕是一种中间胚带型昆虫,仅有前部的体节在囊胚期被特化,后部体节是在细胞化的生长区延伸时依次形成的。不同品系的家蚕其RNA干扰(RNA interference,RNAi)效率不同,本研究表明Nistari的RNAi效率较高,但亲本RNAi(Parental RNAi)在家蚕中并不能起作用。groucho(gro)为共抑制子,参与多个信号通路。将家蚕Bmgro基因RNAi以后,大部分缺陷型明显地缺失了躯干的全部奇数体节,表现出了典型的pair-rule表型,表明Bmgro参与了家蚕体节分节的成对规则过程。且这种周期性的体节缺失可能是由于相邻体节的彼此融合造成的。
Notch信号通路对脊椎动物和蜘蛛的体节分节非常关键,而且果蝇Gro是Notch信号中的调控因子,因此本研究希望探讨gro和Notch信号通路是否在家蚕pair-rule的过程中相互作用。对Notch信号通路的两个关键基因notch和delta进行RNAi导致家蚕胚胎除上颚之外的所有体节和附肢在腹侧正中线处左右对称性地融合,而并未表现出典型的周期性体节缺失。尽管Notch信号通路并未介导Bmgro参与的pair-rule过程,但在家蚕细胞迁移和调控Hox基因中发挥作用。
果蝇runt(run)基因是一个pmr-rule基因,同时具有转录激活和抑制的活性,在果蝇中参与性别决定和体节分节。利用整体原位杂交(Whole-mount in situ hybridization,WISH)对家蚕Bmrunt的研究表明,三个条纹在原肠作用以前次序生成,另外五个条纹随着生长区的延伸而依次形成。八个条纹具有两体节周期的pair-rule方式,且位于奇数副节(parasegment)的后部。弱的次级条纹在偶数体节重新生成。Bmrunt的表达图式符合典型的pair-rule基因特征。Bmrunt的表达在反转期前后经历了消失和再生的过程。对Bmrunt的RNAi导致严重截短的缺失胸腹部的缺陷型。这种cadual-like的表型表明Bmrunt在家蚕体节分节中并未行使pair-rule的作用,但为躯干体节形成和生殖带延伸所必需。