论文部分内容阅读
目的1.检测几种常见嗜肝DNA病毒在胆道闭锁患者肝脏组织中的感染率,探寻其中与胆道闭锁关系最为密切者,并观察该病毒在体外对胆道上皮细胞的的形态学影响;2.分析胆道闭锁患者肝脏组织中人巨细胞病毒与11种CD4~+T细胞因子表达水平之间的相关性。方法1.病例标本新鲜肝脏组织标本来自85例胆道闭锁患者,其中男50例,女35例。并选取新近收集的29例进行流式细胞学检测。同时收集对照组病例9例,其中6例来自引产胚胎,3例来自新生儿肝炎患者。2.荧光定量PCR切取肝脏标本提取DNA,DNA用紫外可见分光光度计进行DNA质量检测后再做FQ-PCR检测。分别对HCMV、ADV、EBV、HBV和HSV 5种病毒进行FQ-PCR进行检测。3.病理及免疫组织化学染色甲醛固定的肝脏标本制成石蜡切片后,进行病理染色和免疫组化检测。病理染色采用HE染色、MASSON染色、个别采用嗜银染色;免疫组织化学染色方法采用二步法对肝脏组织的细胞因子IFN-γ及巨细胞病毒晚期蛋白PP65进行检测,DAB显色。以IFN-γ及PP65表达位于胞浆内,有明显棕黄色颗粒状染色为阳性。4.流式细胞学检测将肝脏组织研磨成组织匀浆,取上清。采用流式微球技术同时对11种细胞因子进行定量检测,具体细胞因子包括:IL-12p70、IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-8、IL-6、IL-4、IL-5、IL-1β、TNF-α和TNF-β。最终各细胞因子浓度(pg/ml·mg)=流式结果(pg/ml)/重量(mg)×500。5.人巨细胞病毒培养及其对人胆道上皮细胞形态学影响5.1人巨细胞病毒培养自行分离提取培养人胚肺成纤维细胞,第3-10代人胚肺成纤维细胞用于本实验,接种HCMV AD 169,对病毒进行培养、扩增,培养过程及结果用FQ-PCR对其病毒滴度进行监测。5.2人巨细胞病毒感染对胆道上皮细胞的影响人肝内胆管上皮细胞接种HCMV AD169株后,每天用倒置相差显微镜观察,至发生明显病变效应时收获。用FQ-PCR检测培养前后病毒滴度变化,再用透射电镜观察细胞形态学变化及病毒状况。6.统计用SPSS 13.0软件计算HCMV滴度与各细胞因子表达量之间的相关系数r。结果1. 5种嗜肝DNA病毒在胆道闭锁肝脏组织中的感染率荧光定量PCR实验结果表明,85例胆道闭锁患者肝脏组织中,嗜肝DNA病毒阳性56例(65.8%),其中HCMV阳性51例(60%),ADV阳性5例(5.9%),EBV阳性3例(3.5%),HSV阳性0例(0%),HBV阳性0例(0%),其中3例出现病毒混合感染,2例为HCMV和ADV混合感染,另外一例为ADV和EBV混合感染。对照组9例均未检测到病毒的存在。2.胆道闭锁组织病理变化胆道闭锁肝脏组织可见肝小叶有不同程度的肝细胞变性坏死、胆汁淤积,部分可见肝多核巨细胞和假小叶形成,汇管区胆栓形成、胆小管增生、胆道上皮细胞变性。以胆小管为中心,淋巴细胞和粒细胞浸润生长,不同程度的纤维束包裹胆小管。3.人巨细胞病毒对人胆道上皮细胞形态学影响及PP65在BA中的分布情况在接种HCMV AD169后,胆道上皮细胞出现细胞病变效应现象,FQ-PCR显示培养后上清中人巨细胞病毒滴度明显升高,电镜下观察到细胞凋亡现象及大量巨细胞病毒在胞浆中存在。85例肝脏标本中,pp65免疫组化阳性43例(50.58%),阴性42例,对照组9例皆为阴性。PP65均位于感染细胞胞浆中,阳性细胞多较集中分布于肝细胞、血管内皮细胞、胆管上皮细胞和炎性浸润细胞。其中胆管上皮细胞呈强阳性反应。4.流式细胞学结果与对照组相比,BA组中11种细胞因子表达水平均不同程度增高,其中Th1细胞因子总量(IL-1β、IL-2、IL-8、IL-12p70、IFN-γ、TNF-α、TNF-β)与促炎因子总量(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12p70、IFN-γ、TNF-α、TNF-β)的增高幅度较Th2细胞因子总量(IL-4、IL-5、IL-6、IL-10)及抗炎因子总量(IL-4、IL-5、IL-10)的增高幅度明显。5. IFN-γ在胆道闭锁患者肝脏组织中的表达情况85例肝脏标本中IFN-γ免疫组化检测阳性51例(60.0%),阴性34例,对照组阴性表达。IFN-γ表达范围主要在汇管区,以增生小胆管为中心,主要表达在胆管周围的炎症细胞胞浆中,胆道上皮细胞呈弱阳性表达。6.人巨细胞病毒滴度与11种CD4~+T细胞因子的相关性分析进行流式细胞学检测的29例胆道闭锁患者中HCMV阳性者15例(51.72%),15例BA患者肝脏组织中人巨细胞病毒滴度与11种细胞因子具有不同程度的相关性,其中与部分细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-4、TNF-α及TNF-β)呈强正相关,以IFN-γ的相关性最强(r=0.796),且该病毒的滴度与Th1细胞因子总量(r=0.914)、促炎因子总量(r=0.913)及11种细胞因子总量(r=0.893)呈强相关性。结论1.胆道闭锁与嗜肝DNA病毒感染之间存在较强的相关性,其中人巨细胞病毒与胆道闭锁之间的相关性较大,人巨细胞病毒对胆道上皮细胞具有侵袭性,可诱发胆道上皮细胞凋亡;2.胆道闭锁有可能是由人巨细胞病毒感染所促发,主要由CD4~+Th1细胞及其细胞因子所介导的针对胆道上皮细胞的免疫炎症性疾病。