背景:阿尔茨海默病(AD)是一种神经系统疾病,呈进行性发展。记忆和认知功能损害以及语言和行为能力缺失是其主要临床表现,随着病情加重,常伴随有严重的失忆症和运动功能减弱,最终导致死亡。在美国国家老年研究所和AD协会于2011年4月发布的一项指南中,将AD自然病史分为3个主要阶段:临床前期、轻度认知功能障碍期(MCI)和AD痴呆期,但多数患者确诊时已处于不可逆转的AD痴呆期。遗忘型轻度认知功能障碍(AMCI)是MCI的重要亚型,与AD的发展进程紧密相关。神经系统组织受血脑屏障的保护,药物很难进入其内,严重限制了应用传统药物治疗AD等神经系统疾病。临床尚不能有效治疗该病,早期诊断、干预成为阿尔茨海默病研究的新方向,但目前尚缺乏特异性和敏感性较高的早期诊断措施。越来越多的研究表明,生物标志物是很多疾病早期诊断、研究疾病发展进程以及指导治疗和评估疗效的重要依据。近年来,代谢组学技术发展迅猛,在寻找生物标志物研究领域的优点逐渐凸显,应用愈加广泛。目前,已有较多有关在脑脊液中寻找有关AD/AMCI等神经系统疾病潜在生物标志物的报道,但因其创伤性较大,对患者不具备良好的顺应性,使得其发展受到严重限制。所以,寻找AD/AMCI生物标志物的研究对象越来越趋向对患者创伤性较小的血清/血浆或者尿液等体液中。运用代谢组学技术于人血清中寻找有关AD/AMCI早期诊断的生物标志物已成为该领域亟待解决的问题。目的:1.建立适用于人血清代谢组学研究的气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法。2.使用GC-MS法分别对AD组、AMCI组和NOR组的血清样本进行检测。3.采用MSD工作站自带的NIST Search 2.0 MS数据库对GC-MS谱图结果进行自动检索比对,鉴定血清中的代谢物质,并经内标峰面积进行标准校正,得到样本中各物质的相对含量。4.使用多元变量数据统计分析方法和单维数据处理方法相结合的方式,对GC-MS所得数据进行预处理及建模分析,寻找三组样本总体之间以及两两对比之间的差异性代谢物,采用MetaboAnlayst3.0在线网站和KEGG数据库剖析代谢通路,探索AD/AMCI的潜在生物标志物和相关代谢通路,以对其致病机制和发展进程进一步了解,从而对该病实现早期诊断和及时治疗提供依据。方法:1.100 μL混合血清样本,加入25 μL内标混匀,加入300 μ乙腈涡旋3min,10800rpm10min。取上清40℃N2吹干,加入50μL氧-甲基羟胺盐酸盐,涡旋混匀1min,转移至1.5 mlEP管,70℃水浴反应1h,加入50μL MSTFA,70℃下继续反应75min。待反应结束,108000rpm涡旋55min,取上清2μL,G-MS进样分析。2.GC-MS分析:Agilent 7890A系列气相色谱仪,HP-5MS毛细管色谱柱(0.25 mm×30m×0.25μm,安捷伦科技),载气(高纯氦气),流速1.0mL/min,压力为20 psi;分流比:50:1;升温程序设定为起始温度80 ℃,保持5 min;以10℃/min的速率升温至300 ℃,保持15 min;进样量为2 μL。Agilent 5975C系列质谱仪,设定进样口、接口、离子源和四级杆温度分别为270 ℃、300℃、230 ℃和150℃,电离电压为70 eV;扫描方式:全扫描模式,50-600 m/z。3.GC-MS图谱使用MSD化学工作站软件自带的NIST Search 2.0 MS数据库进行自动检索匹配,定义相似度大于80%且保留时间漂移小于0.5 min的组分为可鉴定代谢物质。4.应用单维数据处理方法和多元变量数据统计分析相结合的方式,对数据进行多角度分析。单维数据处理方法主要包括非参数的曼-惠特尼秩和检验(M-W)和倍数变化(FC)。多元变量统计分析主要有主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)等。对三组样本同时建模分析,同时三组样本之间两两对比(AD和NOR,AMCI和NOR,AD和AMCI)建模分析,通过建立不同模型,考察样本之间相互分离的情况,并且对所建模型进行检验,考察模型的稳健程度。选取两组之间OPLS-DA中VIP值大于1且M-W检验中P值小于0.05的组分为两组间的差异性代谢物,以FC指标衡量组间差异性代谢物上下调的趋势。应用MetaboAnalyst3.0在线网站剖析其代谢通路,定义得分大于0.01的为AD/AMCI的相关代谢通路,对AD/AMCI的作用机制和潜在生物标志物进行分析探讨。结果:1.共入组102名受试者,根据NINCDS-ADRDA诊断标准分为AD组(30 例)、AMCI 组(32 例)和 NOR组(40 例)。2.建立了检测人血清的GC-MS方法,分析对受试者血清中内源性代谢物质,该方法分离度和重现性良好,适用于人血清代谢组学研究。3.人血清GC-MS总离子流图中,将各色谱峰保留时间漂移限定在0.5 min以内,共得到232个色谱峰,经与NISTSearch2.0质谱数据库进行相关物质自动匹配,以及同种物质合并,能够实现同时检测血清中31种代谢物质。4.11种代谢物为AD组和NOR组之间的差异性代谢物质,AD组血清中羟基丙酸、鸟氨酸和松二糖相较于NOR组呈现上调,其余物质为下调。两组间的差异性代谢物与7条代谢通路密切相关,分别是精氨酸和脯氨酸代谢,苯丙氨酸代谢,丙氨酸代谢,初级胆汁酸合成,谷胱甘肽代谢,淀粉和蔗糖代谢,甾类激素生物合成。其相关影响得分分别为0.182,0.119,0.082,0.055,0.017,0.017,0.016。10种代谢物为AMCI组和NOR组之间的差异性代谢物质,且在AMCI组均呈现下调。两组间的差异性代谢物与7条代谢通路密切相关,包括精氨酸和脯氨酸代谢,苯丙氨酸代谢,柠檬酸循环(TCA循环),丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,牛磺酸和亚牛磺酸代谢,淀粉和蔗糖代谢,甾类激素生物合成等。其相关影响得分分别为 0.130,0.119,0.063,0.057,0.032,0.017,0.012。结论:建立了适用于人血清代谢组学的GC-MS方法,并对AD组、AMCI组和NOR组样本进行检测。对所得数据进行统计分析和代谢通路分析,获得与AD相关的11种差异性代谢物和7条代谢通路以及与AMCI相关的10种差异性代谢物和7条代谢通路。这些变化提示,AD/AMCI患者体内可能存在氨基酸、脂质代谢紊乱,氧化应激损伤、能量代谢障碍等病理生理过程。研究结果有助于进一步了解AD/AMCI的发生发展机制并探索其生物标志物。