论文部分内容阅读
γ-氨基丁酸A型受体(GABAA受体)是一种配体门控氯离子通道,是由多个亚基装配而成的五聚体,它介导了脑内大多数抑制性神经传递的过程,并且它还是镇静催眠类药物包括酒精在内的主要靶点。酒精可以变构地增强GABAA受体的功能[1,2],而慢性酒精激活则可能导致GABAA受体出现可塑性变化,产生酒精耐受,酒精依赖以及酒精戒断综合征(AWS)。突触外含δ亚基的GABAA受体(δ-GABAA受体)对GABA有高亲和力和低效力,脱敏缓慢,对苯二氮卓类药物不敏感,以及在表达α4βδ受体的不同系统中对酒精均表现出高敏感性。研究发现突触外δ-GABAA受体内化可能是酒精引起GABAA受体可塑性改变的“导火索”,PKC介导的受体磷酸化可能参与酒精调节GABAA受体可塑性改变,但是具体机制和可能参与的PKC亚型尚待阐明。本实验在体外原代培养的大鼠海马神经元中,采用电生理、蛋白生化、分子生物学和荧光成像等技术,研究单次剂量酒精撤退引起突触外δ-GABAA受体快速内化的调节机制。我们发现,在单次剂量酒精(60 mM,30分钟)或okadaicacid(100nM,30分钟)预处理/撤退后30分钟,培养海马神经元突触外δ-GABAA受体介导的紧张性抑制电流(tonic current,Itonic)幅度明显减小,急性酒精对Itonic的增强作用也显著降低,即Itonic急性酒精耐受,提示蛋白磷酸化可能参与了单次剂量酒精撤退诱导的突触外δ-GABAA受体功能的降低。应用PKC抑制剂chelerythrine chloride(10 μM)处理可以明显挽救单次剂量酒精撤退引起的Itonic幅度下降和急性酒精耐受,但是PKA抑制剂H89(20 μM)处理则没有明显作用。此外,PKC激动剂佛波酯(100 nM)处理可引起与单次剂量酒精或okadaic acid处理后相似的Itonic幅度下降和急性酒精耐受,而PKA激动剂forskolin(10 μM)则没有作用,这提示我们PKC而非PKA介导的受体磷酸化参与了单次剂量酒精撤退诱导的突触外δ-GABAA受体的迅速内化。进一步实验发现抑制PKC可以阻断单次剂量酒精撤退引起的GABAA受体δ亚基膜表面表达的降低和重组GABAA受体δ亚基荧光强度的下降,进一步支持PKC可能参与酒精撤退对δ-GABAA受体的快速调控。Western blot结果显示单次剂量酒精撤退能够选择性地增加PKCδ而非PKCγ和PKCε的表达。选择性抑制PKCδ亚型不仅能够阻断单次剂量酒精撤退引起GABAA受体δ亚基膜表面表达的降低,而且也能挽救Itonic急性酒精耐受以及重组GABAA受体δ亚基荧光强度的下降。这些结果显示PKCδ亚型参与酒精撤退对突触外δ-GABAA受体的快速调控。以上结果说明,PKCδ介导的受体磷酸化在单次剂量酒精撤退对突触外GABAA受体δ亚基迅速内化的调控中起重要作用。PKCδ的活化很可能是酒精撤退引起GABAA受体可塑性改变的重要基础。这一发现可以为酒精耐受,酒精依赖以及AWS发病的神经生物学机制提供新的科学证据,以及临床治疗的新思路。