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背景
在肾移植(kidney transplantation, KT)中,肾脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)是一个无法避免的过程。IRI常常会诱发肾小管上皮细胞脱落，使尿液中液体和溶质的吸收和排泄功能失调，导致移植术后发生肾功能延迟恢复(delayed graft function, DGF)，严重影响移植受者的预后。然而，关于肾脏IRI如何造成肾小管细胞脱落的具体机制尚未明确，因此，为了改善移植受者的预后，减轻IRI对肾小管造成的不利影响，必须阐明其中的机制。为此，我们利用高通量测序(RNA-seq)检测方法，并在家兔肾脏IRI模型中得到基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase–7, MMP7)在缺血再灌注早期表达显著提高，然而MMP7对肾小管上皮细胞的具体作用尚未明确。
目的
明确在家兔肾脏IRI中MMP7的变化规律，探究MMP7在肾脏IRI中对肾小管上皮细胞的具体作用及机制。为减轻肾脏IRI提供分子靶点。
方法
本研究从在动物实验和细胞试验两大方面对MMP7在肾脏IRI中的作用机制进行探究
(1)在整体水平上，构建家兔肾脏缺血再灌注损伤模型。①将IRI分为缺血(warm ischemia, WI)过程和再灌注(reperfusion, Rep)过程，按照不同缺血时间(warm ischemia time, WIT)分为假手术组(sham)、20min、35min、45min、60min和90min；按照不同再灌注时间分为1h、6h、12h和24h。收取肾脏组织标本及血液标本，对肾脏组织行苏木素-伊红染色(HE staining)、肾脏组织凋亡染色(TUNEL assay)、rt-PCR检测、Westernblotting检测、透射电镜检测(Transmission electron microscopy, TEM)；对血液标本行血清肌酐(serum creatinine, Cr)测定。②将缺血35min再灌注1h的肾脏标本与sham肾脏标本进行RNA-seq检测，检测结果进一步利用Westernblotting进行验证。
(2)在细胞水平上，①构建人近端肾小管上皮细胞(HK-2)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation, H/R)模型，收集细胞进行流式细胞凋亡检测、Westernblotting检测，活性氧自由基检测(ROS detection)；②构建MMP7干扰质粒(Y8671、Y8672、Y8673)，并载入慢病毒载体，干扰MMP7的表达，使用荧光显微镜观察转染效率，并进行Westernblotting检测。③在HK-2缺氧复氧模型基础进行分组，即对照组(control)、缺氧复氧组(H/R)、缺氧复氧+空载体组(H/R+Y004)、缺氧复氧+MMP7干扰质粒组(H/R+Y8672)收集细胞进行Westernblotting检测、免疫荧光染色和免疫共沉淀检测。④在HK-2缺氧复氧模型基础上进一步抑制MMP2/9的表达，收集细胞进行Westernblotting检测。⑤构建HK-2氧化应激模型，采用不同浓度H2O2诱导HK-2产生ROS，进一步干扰MMP7的表达，收集细胞及培养基进行CCK-8试验和Westernblotting试验。
结果
(1)在整体水平上，①HE染色显示随着缺血时间的延长，肾脏组织损伤评分逐渐升高；血肌酐检测显示随着缺血时间的延长，肾功能损伤逐渐加重。同时，当缺血时间为35min时，TUNEL结果显示随着再灌注时间的延长，肾脏组织凋亡水平逐渐增高；肌酐伴随着时间延长而增加；Westernblotting检测各时间点的组织中BCL2/BAX的表达情况发现，随着时间延长，Bcl2/Bax逐渐下降，氧化应激相关酶表达用rt-PCR检测，SOD1mRNA在再灌注6小时达高峰，紧接着出现下降，GPX1mRNA随着时间延长而逐渐下降。②RNA-seq试验结果显示，两组共有201个表达差异基因，其中MMP7和SPP1分别位于上调基因中第1位和第3位；MMP7和SPP1在缺血再灌注组表达明显增高相较于sham组。Westernblotting结果显示MMP7和SPP1蛋白水平明显增高相较于Sham组；同时，蛋白互作发现MMP7和SPP1与细胞外基质相关蛋白具有相关性。③Westernblotting结果显示，随着肾脏再灌注时间的延长，MMP2/7/9及SPP1逐渐增高，再灌注1h时仅有MMP7和SPP1增高，而MMP2/9并未增加。取再灌注6h的肾脏组织做TEM观察，结果显示，在再灌注6h后，肾脏动脉内皮细胞开始出现脱落，肾小管上皮细胞间连接蛋白减少，间隙增大。随后用Westernblotting检测肾脏组织中SDC1和TJP1的表达发现，随着灌注时间延长其表达逐渐减少。
(2)在细胞水平上，①Westernblotting检测显示HUVECs的MMP7和SPP1的表达极少，相较于HK-2；并发现在HK-2缺氧复氧模型中，随着复氧时间延长，ROS产生逐渐增加，MMP2/7/9和SPP1表达也逐渐增高；②荧光显微镜显示慢病毒在MOI为50时转染效率大于99%，Westernblotting检测发现质粒Y8672具有更好的敲低效率。③当干扰MMP7表达后，Westernblotting结果显示H/R不再使MMP7表达增高；同时与H/R+Y004组相比，H/R+Y8672组MMP2/9和SPP1的表达无明显变化，但SDC1和TJP1表达明显增高，免疫荧光染色也显示干扰MMP7后，SDC1和TJP1的表达均增高。④特异性抑制MMP2/9的表达后，Westernblotting检测显示MMP7不受MMP2/9抑制剂的影响，但相较于H/R组，干扰MMP2/9后SDC1和TJP1表达明显增高。⑤氧化应激模型显示，随着H2O2浓度增高，细胞活性逐渐下降，pro-MMP2/9和cleaved-MMP2/9表达逐渐增高，进一步干扰MMP7的表达发现pro-MMP2/9并无明显改变但cleaved-MMP2/9表达明显降低。⑥免疫共沉淀试验显示，敲低MMP7后，TJP1与MMP2/9的结合下降，CD44分子表达减少，并且SPP1与CD44的结合减弱。
结论
(1)在肾脏IRI中，随着损伤加重，MMP2/7/9和SPP1表达逐渐增加，而SDC1和TJP1表达逐渐下降；并且MMP7和SPP1的表达先于MMP2/9。提示MMP7和SPP1可以作为肾脏IRI的生物标志物。
(2)MMP7不直接调节MMP2/9的表达，但参与MMP2/9的激活，激活后的MMP2/9能够结合并降解SDC1和TJP1，破坏肾小管细胞的完整性。
(3)干扰MMP7的表达可以减弱SPP1与CD44的结合进而减轻炎症反应。
在肾移植(kidney transplantation, KT)中,肾脏缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)是一个无法避免的过程。IRI常常会诱发肾小管上皮细胞脱落，使尿液中液体和溶质的吸收和排泄功能失调，导致移植术后发生肾功能延迟恢复(delayed graft function, DGF)，严重影响移植受者的预后。然而，关于肾脏IRI如何造成肾小管细胞脱落的具体机制尚未明确，因此，为了改善移植受者的预后，减轻IRI对肾小管造成的不利影响，必须阐明其中的机制。为此，我们利用高通量测序(RNA-seq)检测方法，并在家兔肾脏IRI模型中得到基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase–7, MMP7)在缺血再灌注早期表达显著提高，然而MMP7对肾小管上皮细胞的具体作用尚未明确。
目的
明确在家兔肾脏IRI中MMP7的变化规律，探究MMP7在肾脏IRI中对肾小管上皮细胞的具体作用及机制。为减轻肾脏IRI提供分子靶点。
方法
本研究从在动物实验和细胞试验两大方面对MMP7在肾脏IRI中的作用机制进行探究
(1)在整体水平上，构建家兔肾脏缺血再灌注损伤模型。①将IRI分为缺血(warm ischemia, WI)过程和再灌注(reperfusion, Rep)过程，按照不同缺血时间(warm ischemia time, WIT)分为假手术组(sham)、20min、35min、45min、60min和90min；按照不同再灌注时间分为1h、6h、12h和24h。收取肾脏组织标本及血液标本，对肾脏组织行苏木素-伊红染色(HE staining)、肾脏组织凋亡染色(TUNEL assay)、rt-PCR检测、Westernblotting检测、透射电镜检测(Transmission electron microscopy, TEM)；对血液标本行血清肌酐(serum creatinine, Cr)测定。②将缺血35min再灌注1h的肾脏标本与sham肾脏标本进行RNA-seq检测，检测结果进一步利用Westernblotting进行验证。
(2)在细胞水平上，①构建人近端肾小管上皮细胞(HK-2)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧复氧(hypoxia-reoxygenation, H/R)模型，收集细胞进行流式细胞凋亡检测、Westernblotting检测，活性氧自由基检测(ROS detection)；②构建MMP7干扰质粒(Y8671、Y8672、Y8673)，并载入慢病毒载体，干扰MMP7的表达，使用荧光显微镜观察转染效率，并进行Westernblotting检测。③在HK-2缺氧复氧模型基础进行分组，即对照组(control)、缺氧复氧组(H/R)、缺氧复氧+空载体组(H/R+Y004)、缺氧复氧+MMP7干扰质粒组(H/R+Y8672)收集细胞进行Westernblotting检测、免疫荧光染色和免疫共沉淀检测。④在HK-2缺氧复氧模型基础上进一步抑制MMP2/9的表达，收集细胞进行Westernblotting检测。⑤构建HK-2氧化应激模型，采用不同浓度H2O2诱导HK-2产生ROS，进一步干扰MMP7的表达，收集细胞及培养基进行CCK-8试验和Westernblotting试验。
结果
(1)在整体水平上，①HE染色显示随着缺血时间的延长，肾脏组织损伤评分逐渐升高；血肌酐检测显示随着缺血时间的延长，肾功能损伤逐渐加重。同时，当缺血时间为35min时，TUNEL结果显示随着再灌注时间的延长，肾脏组织凋亡水平逐渐增高；肌酐伴随着时间延长而增加；Westernblotting检测各时间点的组织中BCL2/BAX的表达情况发现，随着时间延长，Bcl2/Bax逐渐下降，氧化应激相关酶表达用rt-PCR检测，SOD1mRNA在再灌注6小时达高峰，紧接着出现下降，GPX1mRNA随着时间延长而逐渐下降。②RNA-seq试验结果显示，两组共有201个表达差异基因，其中MMP7和SPP1分别位于上调基因中第1位和第3位；MMP7和SPP1在缺血再灌注组表达明显增高相较于sham组。Westernblotting结果显示MMP7和SPP1蛋白水平明显增高相较于Sham组；同时，蛋白互作发现MMP7和SPP1与细胞外基质相关蛋白具有相关性。③Westernblotting结果显示，随着肾脏再灌注时间的延长，MMP2/7/9及SPP1逐渐增高，再灌注1h时仅有MMP7和SPP1增高，而MMP2/9并未增加。取再灌注6h的肾脏组织做TEM观察，结果显示，在再灌注6h后，肾脏动脉内皮细胞开始出现脱落，肾小管上皮细胞间连接蛋白减少，间隙增大。随后用Westernblotting检测肾脏组织中SDC1和TJP1的表达发现，随着灌注时间延长其表达逐渐减少。
(2)在细胞水平上，①Westernblotting检测显示HUVECs的MMP7和SPP1的表达极少，相较于HK-2；并发现在HK-2缺氧复氧模型中，随着复氧时间延长，ROS产生逐渐增加，MMP2/7/9和SPP1表达也逐渐增高；②荧光显微镜显示慢病毒在MOI为50时转染效率大于99%，Westernblotting检测发现质粒Y8672具有更好的敲低效率。③当干扰MMP7表达后，Westernblotting结果显示H/R不再使MMP7表达增高；同时与H/R+Y004组相比，H/R+Y8672组MMP2/9和SPP1的表达无明显变化，但SDC1和TJP1表达明显增高，免疫荧光染色也显示干扰MMP7后，SDC1和TJP1的表达均增高。④特异性抑制MMP2/9的表达后，Westernblotting检测显示MMP7不受MMP2/9抑制剂的影响，但相较于H/R组，干扰MMP2/9后SDC1和TJP1表达明显增高。⑤氧化应激模型显示，随着H2O2浓度增高，细胞活性逐渐下降，pro-MMP2/9和cleaved-MMP2/9表达逐渐增高，进一步干扰MMP7的表达发现pro-MMP2/9并无明显改变但cleaved-MMP2/9表达明显降低。⑥免疫共沉淀试验显示，敲低MMP7后，TJP1与MMP2/9的结合下降，CD44分子表达减少，并且SPP1与CD44的结合减弱。
结论
(1)在肾脏IRI中，随着损伤加重，MMP2/7/9和SPP1表达逐渐增加，而SDC1和TJP1表达逐渐下降；并且MMP7和SPP1的表达先于MMP2/9。提示MMP7和SPP1可以作为肾脏IRI的生物标志物。
(2)MMP7不直接调节MMP2/9的表达，但参与MMP2/9的激活，激活后的MMP2/9能够结合并降解SDC1和TJP1，破坏肾小管细胞的完整性。
(3)干扰MMP7的表达可以减弱SPP1与CD44的结合进而减轻炎症反应。