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microRNA(miRNA)是一种内源性的小RNA,长度约为21到25个核苷酸大小。miRNA不仅调控植物的生长发育,还在多种逆境胁迫下发挥着重要的调控作用。本研究在前人野生大豆miRNA发现的基础上,以耐盐野生大豆ZYD3474为材料,获得了盐胁迫相关的miRNA。本研究旨在探索miRNA在植物耐盐方面的功能,挖掘野生大豆的优异耐盐miRNA基因。同时本研究丰富了miRNA功能的研究方法,为深入开展miRNA功能的研究提供了重要手段。野生大豆耐盐miRNA的研究有利于开拓植物耐盐机制的新视野,为大豆耐盐新种质的创制打下了良好的基础,对加速盐渍化土壤的开发与利用有重要的意义。本研究获得了如下主要结果:1.获得了盐胁迫相关的候选miRNA。以耐盐野生大豆ZYD3474为材料,通过Northern杂交,在野生大豆中现有的miRNA的基础上,在芽期、苗期和成熟期三个时期对盐处理和对照样本进行了miRNA表达检测,获得了差异表达的miRNA。其中miR319、miR160和miRN2盐胁迫条件下上调表达,miRN18盐胁迫条件下下调表达。栽培大豆与野生大豆都是Glycine属soja亚属的成员,两个物种之间只有品种间的差异。通过构建栽培大豆Williams82盐胁迫和正常条件下的小RNA文库,获得了差异表达的miRNAs。与野生大豆Northern杂交结果进行对比,一方面证实了miRNA在栽培大豆和野生大豆中差异表达的一致性,另一方面进一步补充了候选盐胁迫相关的miRNA。从Williams82的miRNA差异表达分析中,初步获得了显著有差异的盐胁迫相关的miRNA。其中,miR160,miR169,miR2109,miR319,miR394和miR4359发生上调表达,miR164,miR167,miR4340和miR4361发生下调表达。利用miRNA qRT-PCR检测表达差异的miRNAs在盐处理下栽培大豆Williams82和野生大豆ZYD3474中在不同时段的表达,发现miRNA在二者中表达模式基本一致。2.成功建立并验证了一种新的植物高效的miRNA功能干扰系统。本研究以CaMV 35S为启动子,构建了拟南芥的6个保守性miRNA(miR156、miR157、miR164、miR167、miR319和miR172)的miRNA功能干扰载体。利用载体上与miRNA核心序列裂解位点三碱基不匹配结构,干扰miRNA在植物体内的功能从而实现相关研究。通过农杆菌EHA105介导转化拟南芥,最终获得了MIM纯系稳定株系。利用qRT-PCR技术,以Tubulin为内参基因,我们检测了miRNA靶基因的表达。结果显示,与野生型拟南芥相比,MIM株系中除MIM172的靶基因外,其余株系靶基因的表达均发生明显上调,最高上调幅度达到61.4倍,这表明该系统能稳定高效的对miRNA功能进行干扰。miRNA功能干扰系统为植物miRNA的功能研究提供了重要手段。3.对拟南芥MIM株系进行了初步耐盐鉴定。在土壤水分和渗透压下降的情况下,植物幼苗的形态建成依赖于种子的萌发、生长以及析出盐离子的能力。植物的萌发率以及苗期的属性是植物耐盐性鉴定的最可行方法。利用萌发率、存活率以及表型观察的手段对MIM株系进行盐相关表型的鉴定。盐胁迫条件下三种MIM株系的各方面表现显示,候选盐胁迫相关的miRNA的功能对植物耐盐性有一定的相关性,其中miR164与miR167与植物耐盐负相关,而miR319与植物耐盐正相关。由于miR319、miR164以及miR167都能够直接或者间接调节植物体内的激素水平,因此,MIM株系可能由miRNA影响信号通路进而对植物耐盐性产生影响。