论文部分内容阅读
类胡萝卜素（carotenoids）是类异戊二烯化合物及其通过氧化氢化脱氢环化酮基化，以及碳架的重排降解等作用的衍生物，广泛存在于花卉水果蔬菜藻类细菌真菌中，分为不含氧原子的胡萝卜素（carotenes）族和含氧官能团（如羟基环氧基甲氧基等）的衍生物及其酯类的叶黄素（xanthophylls）族由于富含叶黄素等类胡萝卜素，小球藻（Chlorella）作为一种极具潜力的叶黄素源而备受关注目前关于小球藻类胡萝卜素的研究中，主要采用培养条件的优化和提取工艺的改进来提高叶黄素产量，少见采用代谢途径改造等基因工程的办法来实现这一目标本论文将类胡萝卜素代谢过程中关键限速酶八氢番茄红素脱氢酶（phetoene desaturase，PDS）和ζ-胡萝卜素脱氢酶（ζ-carotene desaturase，ZDS）的基因作为研究对象，通过对原壳小球藻（Chlorella protothecoides CS-41）PDS ZDS基因的克隆和特征分析，为进一步揭示类胡萝卜素合成的分子代谢机制奠定基础，此外，还对原壳小球藻的遗传转化条件进行了初步的探索主要研究内容及结果如下：1通过cDNA末端快速扩增（RACE）和RT-PCR对C. protothecoidesCS-41核基因组上的PDS ZDS基因进行扩增，得到2054bp PDS基因的cDNA序列（GenBank登录号：FJ968162），及大小分别为3857bp（GenBank登录号：GU269620）和1802bp（GenBank登录号：GU269621）的两条PDS基因的DNA序列；以及得到了2031bp ZDS基因的cDNA序列（GenBank登录号：GU269622）及其4713bp的DNA序列（GenBank登录号：GU269623）2通过PDS ZDS基因对应的氨基酸序列的生物信息学分析，发现它与高等植物和其它藻类的相应基因具有很高的相似性，在PDS ZDS基因对应的氨基酸序列中都发现了三个类似的功能区域：典型的双核苷酸结合位点底物运输结合位点和类胡萝卜素的结合位点，并在N端都发现了转运肽的存在同时，进化树分析结果表明，藻类群中小球藻和衣藻的亲缘关系比较近3成功构建了原核表达载体pET-PDS，通过IPTG诱导，使PDS基因在宿主菌BL21(DE3)中成功地高效表达，并通过Western blot免疫印迹法分析，进一步表明所表达的融合蛋白就是PDS通过颜色互补反应，证实了PDS蛋白能够催化两步脱氢反应，将无色的八氢番茄红素转化成浅黄色的ζ-胡萝卜素，同时也证明了原壳小球藻的PDS蛋白属于植物型的八氢番茄红素脱氢酶4通过研究原壳小球藻对六种常用抗生素的敏感性，确定了原壳小球藻遗传转化可以采用的筛选抗生素种类及其工作浓度，发现原壳小球藻对G418最敏感，工作浓度为10μg/ml，为后续的原壳小球藻基因工程研究奠定了基础5以载体pHB为基础，成功构建了植物表达载体pHB-PDS，初步尝试通过农杆菌介导法将植物表达载体pHB-PDS转入模式生物拟南芥中，成功获得了抗性植株，其功能验证正在进行中