研究背景：骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤。对于那些在诊断的时候没有发生转移的患者,其5年生存率可达70%。尽管取得了许多进展,然而其余的有转移的或者对化疗不敏感的骨肉瘤患者,其5年生存率只有20%左右。骨肉瘤的真正病因尚不清楚,其发生发展过程是一个包括环境因素和遗传因素的多因素过程。表观遗传学的最新研究进展表明,表观遗传改变可引起骨肉瘤的恶性转化和进展,让我们可以更好地了解这种肿瘤的分子机制。代谢型谷氨酸受体4(mGluR4)主要是突触前谷氨酸受体,其在控制运动的基底神经节环路的数个关键位置表达,参与突触前兴奋性谷氨酸信号的神经传递。研究表明代谢型谷氨酸受体4(mGluR4)在多种肿瘤中表达并与其进组预后相关,在成骨细胞和破骨细胞中mGluR4的表达表明谷氨酸信号参与骨形成和骨吸收过程中的细胞分化与调控。目的：研究表明在骨肉瘤中代谢型谷氨酸受体4(mGluR4)呈高表达状态。本研究检测63例骨肉瘤患者的骨组织和105例非肿瘤患者的骨组织中GRM4基因启动子甲基化状态以及表达情况,探讨GRM4基因启动子甲基化与其表达的关联及其在骨肉瘤中的临床意义。方法：研究对象及标本：收集2010年1月-2012年7月期间在广西医科大学第一附属医院诊疗的骨肉瘤患者组织标本63例。所有患者术前未进行相关抗癌治疗措施,所有标本经过病理学检查确认为骨肉瘤。取得的标本在切除后立即置入液氮罐冷冻保存,然后转到-80℃条件下低温保存。取得105例非肿瘤患者的骨组织作为对照组,同样经液氮冷冻低温保存,后转到-80℃低温冰箱保存用于基因甲基化、RNA和蛋白测定。并且收集患者的临床和组织学资料,如年龄、性别、Enneking分期、转移、肿瘤部位、组织学类型。所有患者均进行随访,术后前2年内每2个月进行1次随访,在接下来的随访过程中每6个月随访一次,平均随访时间为20个月(1月-36月)。这项研究由广西医科大学附属第一医院伦理委员会批准,每一位患者在告知的情况下签署知情同意书。GRM4基因启动子甲基化的测定：通过焦磷酸测序的方法检测骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4基因启动子的甲基化状态。GRM4基因mRNA表达的测定：通过RT-PCR的方法测定骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4基因的mRNA水平的表达。GRM4基因蛋白表达的测定：通过Western Blot(WB)的方法测定骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4基因的蛋白水平的表达。统计学分析：应用SPSS 16(IBM,Armonk,NY,USA)进行统计分析。采用独立样本t检验来比较骨肉瘤组织和癌旁组织的甲基化水平、基因表达和蛋白表达的差异。用斯皮尔曼相关性(Spearman correlation)检测GRM4基因甲基化和基因表达之间的相关性。GRM 4甲基化水平与临床病理特征(包括年龄,性别,阶段,外科分期,病理组织学类型,位置,和转移)之间的关系则用卡方检验或Fisher确切概率法。应用Kaplan-Meier分析和Log-rank检验分析骨肉瘤患者的总生存期(OS)、无复发生存率(RFS)和无进展生存期(PFS),其中需要排除在末次随访仍然存活的患者。P值<0.05,被认为有统计学意义。结果：在骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4基因启动子甲基化的情：通过焦磷酸测序的方法检测GRM4基因启动子甲基化状态。在骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中平均甲基化水平分别是3.79±0.83%和4.08±0.74%,其中P<0.05。这说明相对于非肿瘤患者的骨组织而言,在骨肉瘤组织中GRM4基因启动子表现为低甲基化。在骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4 mRNA水平的表达情况：用RT-PCR的方法检测骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4 mRNA水平的表达情况。在骨肉瘤组织中GRM4 mRNA的灰度值为1.71±0.15,而在正常骨组织中其值为0.56±0.13,P<0.05,有统计学意义。其结果表明与非肿瘤患者的骨组织中相比,在骨肉瘤组织中GRM4mRNA呈现高表达。在骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4蛋白水平的表达情况：用免疫印迹分析方法(WB)的方法检测骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中GRM4蛋白水平的表达情况。在骨肉瘤组织中的值为1.28±0.08,而在正常骨组织中其值为0.35±0.05,P<0.05,有统计学意义。其结果表明与非肿瘤患者的骨组织中相比,在骨肉瘤组织中GRM4蛋白呈现高表达。通过斯皮尔曼相关性(Spearman correlation)检验发现GRM4基因的甲基化与其表达之间有一个显着的负相关(r=-0.211,P=0.016)。GRM4甲基化水平与临床病理参数的关系：根据GRM4基因甲基化状态,将甲基化水平四等分：Q1(≥4.51,n=16),Q2(3.34-4.51,n=16),Q3(3.04-3.34,n=15)以及Q4(≤3.04,n=16)。分析GRM4甲基化水平与临床病理参数的关系,其结果表明GRM4甲基化水平与肿瘤转移(P<0.05)和复发(P<0.05)密切相关,但是与年龄,性别,Enneking分期、病理类型及肿瘤位置不相关(所有P>0.05)。生存分析：我们设定Q4为低甲基化组,而Q1、Q2和Q3作为高甲基化组。应用Kaplan-Meier分析和Log-rank检验分析骨肉瘤患者的总生存期(OS)、无复发生存率(RFS)和无进展生存期(PFS)。分析结果表明,相对于低甲基化组而言,高甲基化组有更长的平均生存时间(OS),P<0.05。同样的,无复发生存时间(RFS),P<0.05和无进展生存期(PFS)的分析中,高甲基化组有更长的生存时间,P<0.05。结论：(1)在骨肉瘤组织及非肿瘤患者的骨组织中平均甲基化水平的测定说明相对于非肿瘤患者的骨组织中而言,在骨肉瘤组织中GRM4基因表现为低甲基化。(2)RT-PCR结果表明与非肿瘤患者的骨组织中相比,在骨肉瘤组织中GRM4 mR NA呈现高表达。(3)免疫印迹分析方法(WB)结果表明与非肿瘤患者的骨组织中相比,在骨肉瘤组织中GRM4蛋白呈现高表达。(4)GRM4甲基化水平与临床病理参数的结果表明GRM4甲基化水平与肿瘤转移和复发密切相关。(5)生存分析结果表明,相对于低甲基化组而言,高甲基化组有更长的平均生存时间。同样的,无复发生存率(RFS)和无进展生存期(PFS)的分析中,高甲基化组有更长的生存时间。