论文部分内容阅读
[目的] 研究大气细颗粒物(PM2.5)对儿童骨髓基质细胞(BMSCs)增殖、分化及细胞因子分泌的影响。探讨PM2.5对儿童骨髓造血微环境的毒性作用,为环境污染与血液系统疾病的发生发展关系提供理论基础。 [方法] 1.采集PM2.5颗粒并配制成终浓度为10μg/ml,20μg/ml,50μg/ml,100μg/ml,200μg/ml的PM2.5溶液。 2.用密度梯度离心法提取儿童骨髓单个核细胞,流式细胞仪鉴定细胞表型,取对数生长期的细胞用于实验研究。 3.倒置显微镜观察原代培养的儿童BMSCs形态学变化。 4.CCK-8法检测不同浓度的PM2.5溶液作用于儿童BMSCs12、24、48h后增殖的影响。 5.茜素红染色鉴定成骨细胞。 6.CCK-8法检测不同浓度的PM2.5溶液对儿童BMSCs在成骨分化过程中3、7、10、14d时增殖的影响。 7.碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测不同浓度的PM2.5溶液对儿童BMSCs在成骨分化过程中3、7、10、14d时分泌ALP活性能力的影响。 8.LISA法检测不同浓度的PM2.5溶液染毒儿童BMSCs24h后对细胞因子G-CSF、GM-CSF分泌量的影响。 9.RT-PCR法检测不同浓度的PM2.5溶液染毒儿童BMSCs24h后对细胞因子G-CSF、GM-CSF的mRNA表达水平的影响。 [结果] 1.置显微镜下观察原代培养的儿童BMSCs:1周时,可见散在的细胞集落形成,细胞集落随时间迅速增大。10-14天时,各个集落之间的细胞逐渐融合成单层细胞,铺满瓶底。传代后的细胞形成较为均一的长梭形,均匀分布,第1-4代的细胞生长迅速、状态良好,传至第5代时,细胞生长缓慢,形态不规则。 2.CCK-8法检测BMSCs增殖结果:低浓度(10、20μg/ml)的PM2.5溶液刺激BMSCs增殖,高浓度(50、100、200μg/ml)的PM2.5溶液抑制BMSCs增殖,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且同一时间不同浓度组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。随着作用时间延长,BMSCs的增殖逐渐下降,同一浓度不同时间组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。 3.PM2.5对BMSCs分化的影响 3.1 PM2.5对BMSCs在成骨分化过程中增殖的影响结果:3天时,低浓度(10、20μ g/ml)的PM2.5溶液促进BMSCs增殖,高浓度(50、100、200μg/ml)的PM2.5溶液抑制BMSCs增殖,但7天以后,各浓度的PM2.5溶液对BMSCs的增殖均有明显的抑制作用,同一时间不同浓度组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。随着作用时间延长,BMSCs增殖一直处于抑制状态,且同一浓度不同时间组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。 3.2 PM2.5对BMSCs在成骨分化过程中分泌ALP活性能力的影响结果:3-10天时,随着作用时间延长,ALP活性逐渐增强,但到14天时,ALP活性又逐渐降低,同一浓度不同时间组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。同一时间,随着PM2.5溶液浓度升高,ALP活性逐渐受到抑制,与成骨分化阴性对照组(0μg/ml)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。同一时间不同浓度组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。 4.ELISA法检测BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF分泌情况结果:低浓度(10、20μg/ml)的PM2.5溶液对BMSCs分泌的细胞因子G-CSF、GM-CSF促进作用明显,高浓度(50、100、200μg/ml)的PM2.5溶液对BMSCs分泌的细胞因子G-CSF、GM-CSF起抑制作用,与对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05),同一细胞因子不同浓度组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。 5.RT-PCR法检测BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF的mRNA表达水平的影响结果:低浓度(10、20μg/ml)的PM2.5溶液促进BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF的mRNA表达,高浓度(50、100、200μg/ml)抑制BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF的mRNA表达,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度组间比较,差异不完全有统计学意义。 [结论] 1.低浓度(10、20μg/ml)PM2.5溶液促进BMSCs的增殖,高浓度(50、100、200μg/ml)PM2.5溶液抑制BMSCs的增殖。 2.PM2.5抑制BMSCs在成骨分化过程中的增殖,且呈时间和浓度依赖性。 3.短时间内(3-10d),随着处理时间的延长,PM2.5促进ALP活性,长时间(14d)后PM2.5抑制ALP活性,且PM2.5呈浓度依赖性抑制ALP活性。 4.低浓度(10、20μg/ml)PM2.5促进BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF的分泌,高浓度(50、100、200μg/ml) PM2.5抑制BMSCs细胞因子G-CSF、GM-CSF的分泌。 5.PM2.5对儿童BMSCs具有细胞毒性作用。