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研究背景:鞘氨醇激酶(Sphingosine kinase,SphK)家族具有两个成员鞘氨醇激酶1(SphK1)与鞘氨醇激酶2(SphK2)[1-5],虽然两者都是ATP依赖的蛋白激酶,但两者的生物学功能不尽相同[2,6]。以往的研究发现特别其中的SphK1在多种恶性肿瘤中存在着高表达[7],并且其高表达与肿瘤患者的预后密切相关[8,9]。SphK1在恶性多形性神经胶质细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)中也存在高表达,并且与相对与细胞中低表达SphK1的胶质瘤患者相比,细胞中SphK1高表达的胶质瘤患者平均生存时间明显减少,显示SphK1对胶质瘤细胞的生长以及其患者预后密切相关[10,11]。相较于SphK1,而SphK2在肿瘤中的作用目前并不十分明确,但其可以在细胞核内发挥作用,调控组蛋白的乙酰化,进而影响到多种基因的表达[12,13]。
鞘氨醇激酶催化使鞘氨醇(sphingosine)使其磷酸化生成鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine—1-phosphate,S1P),其为一种脂质分子,可以具有调控细胞的生存,凋亡[14];胞内钙离子的平衡[15];以及血管的生成等多种生命进程的功能[16-19];并且在肿瘤的发生、发展及耐药性的产生中发挥重要作用[20,21]。目前认为是行使鞘氨醇激酶的生理功能的重要信号分子。S1P可以通过两种方式发挥作用,一种为以自分泌或旁分泌的方式释放到细胞外与其相应的受体结合发挥功能[22];另一种方式为直接在胞内发挥其信号分子作用[23]。人类细胞的细胞膜上存在五种亚型S1P的受体的亚型(S1P1-5),其中S1P1-3广泛表达,在胶质瘤中也存在[24]。S1P的受体为Gi型的G蛋白偶联的受体,与其相应的配体结合后可以激活磷脂酶C(PLC),进而活化下游的信号通路,发挥其生物学效应[25,26]。以往研究发现由于肿瘤组织生长迅速,而血管生成较慢,血供不足,因此在实体肿瘤组织中存在着明显的缺氧现象[27]。在胶质瘤的研究中发现胶质瘤细胞不仅可以对缺氧微环境耐受,缺氧还可以降低胶质瘤细胞对放疗及化疗药物的敏感[28]。而且2008年Viviana Anelli等人的研究发现SphK1在缺氧过程中表达上调,活性增强,但此现象对胶质瘤生长的作用并不清楚。本研究以缺氧条件下的胶质瘤细胞为研究对象,对鞘氨醇激酶是否参与胶质瘤的生长调控以及其分子机制进行探讨,以期了解胶质瘤在缺氧微环境中的生长以及细胞信号的调节机制,为可能胶质瘤的分子治疗提供理论基础。
目的:本研究通过CoCl2模拟缺氧,在此模型基础上探讨鞘氨醇激酶在胶质瘤细胞生长中的作用及其机制,研究缺氧微环境下胶质瘤细胞信号调节通路,以期为恶性胶质瘤的治疗研究提供新思路。
方法
1.以3%O2或150μM CoCl2建立体外缺氧的模型,通过CCK-8检测缺氧条件下鞘氨醇激酶抑制剂SKI对神经胶质细胞瘤细胞系U251和U87MG细胞生长的影响。
2.通过免疫荧光技术,使用激光共聚焦显微镜观察SphK1与SphK2在U87MG细胞内表达情况,以western blot检测缺氧对SphK1和SphK2表达的影响。
3.通过RNAi下调SphK1与SphK2表达。分别用quantitative RT-PCR和western blot检测SphK1与SphK2 mRNA和蛋白水平的变化,以CCK-8检测在缺氧条件下SphK1与SphK2下调对U87MG细胞生长的影响。
4.通过RNAi下调SphK1和SphK2的表达后,以流式细胞术检测鞘氨醇激酶在缺氧条件下对U87MG细胞周期的影响。
5.Western blot检测缺氧条件下ERK磷酸化水平的变化。
6.以U0126抑制ERK的活化,以CCK-8检测缺氧条件下U0126对U87MG细胞生长的影响,以流式细胞术检测缺氧条件下其对U87MG细胞周期的影响。
7.以鞘氨醇激酶抑制剂SKI预孵30 min抑制鞘氨醇激酶的活性,或SphK1siRNA—1干扰SphK1的表达、SphK2 siRNA-2干扰SphK2的表达后,将细胞缺氧处理1 h,以Western blot检测ERK磷酸化的变化,以观察鞘氨醇激酶对缺氧条件下ERK活化的影响。
8.以PTX抑制Gi型的G蛋白的活性,以U73122抑制磷脂酶C的活性,以CCK-8检测缺氧条件下两者对U87MG细胞生长的影响,以流式细胞术检测缺氧条件下两者对U87MG细胞周期的影响,以western blot检测两者对缺氧条件下U87MG细胞ERK磷酸化的影响。
结果
1.与常氧组相比,3%O2或150μMCoCl2缺氧处理对细胞增殖无明显影响。鞘氨醇激酶抑制剂SKI均显著抑制神经胶质瘤细胞系U251和U87MG的增殖。在3%O2缺氧条件下,在U251细胞中与对照组相比相对细胞数分别在48 h、72 h下降了109.2%、289.2%;在U87MG细胞中,与对照组相比相对细胞数分别在48 h、72 h下降了99.7%、269.3%,均有显著统计学差异(P<0.05,n=6)。在150μM CoCl2模拟缺氧条件下在U251细胞中与对照组相比相对细胞数分别在48 h、72 h下降了148.3%、269.4%;在U87MG细胞中,与对照组相比相对细胞数分别在48 h、72 h下降了138.9%、296.5%,均有显著统计学差异(P<0.05,n=6)。
2.SphK1与SphK2在U87MG细胞内广泛表达;缺氧诱导SphK1表达增加,在150μM CoCl2缺氧处理1 h后较未处理组表达开始增高(1.40 vs.1),4 h后达到峰值(1.73 vs.1),均有显著统计学差异(P<0.05,n=4)。而SphK2的表达在缺氧处理1 h后持续下降,在12 h后下降到对照组的58%,具有显著统计学差异(P<0.05,n=4)。
3.两个SphK1特异性的siRNAs:SphK1 siRNA—1和SphK1 siRNA-2转染后72h,分别使SphK1 mRNA水平的表达减少到19.4%和31.2%(P<0.05,n=8);SphK1蛋白水平的表达减少到阴性对照组的34.5%和83.7%(P<0.05,n=4)。SphK1 siRNA-1干扰组细胞SphK1表达明显下调,与转染阴性对照的细胞相比,转染SphK1 siRNA-1的U87MG细胞生长明显受抑制(69.7%vs.100%)(P<0.05,n=6)。
4.两个SphK2特异性的siRNAs:SphK2 siRNA-1和SphK2 siRNA-2转染后72 h,分别使SphK2 mRNA水平的表达减少到40.8%和30.1%(P<0.05,n=8);SphK2蛋白水平的减少到对照组的97.98%和33.9%,SphK2 siRNA-2干扰组细胞SphK2表达明显下调(P<0.05,n=5)。与转染阴性对照的细胞相比,转染SphK2siRNA-2片段的U87MG细胞生长明显受抑制(73.7%vs.100%)(P<0.05,n=6)。
5.阴性对照组相比,转染SphK1特异性干扰片段SphK1 siRNA-1的U87MG细胞出现明显的周期阻滞,阻滞于G2/M期(28.1%vs.11.6%)(P<0.05,n=3);而转染SphK2特异性干扰片段SphK2 siRNA-2的U87MG细胞亦出现明显的周期阻滞,阻滞于S期(26.5%vs.18.9%)(P<0.05,n=3)。
6.磷酸化的ERK在150μM COCl2缺氧处理15 min后开始增高,60 min后达到峰值,而后有逐步下降。
7.在缺氧条件下,ERK抑制剂U0126显著抑制U87MG细胞的生长,U0126处理组U87MG细胞与对照组相比相对细胞数分别在48 h、72 h下降了105.4%、274.4%,均有显著统计学差异(P<0.05,n=6);并且使U87MG细胞阻滞于G2/M期,与对照组相相比,U0126处理组的G2/M期细胞增加了4.93%,有显著统计学差异(P<0.05,n=3)。
8.鞘氨醇激酶抑制剂SKI预孵30 min抑制SphK的活性,或SphK1 siRNA-1干扰SphK1的表达后,将细胞缺氧处理1 h,鞘氨醇激酶活性的抑制与SphK1表达的下调均抑制由缺氧引起的ERK的磷酸化的增加。然而SphK2 siRNA-2干扰SphK2的表达后,将细胞缺氧处理1 h,SphK2表达的下调对缺氧引起的ERK的磷酸化无明显的影响。
9.0.5μM S1P显著减弱了由于SphK1表达下调引起的U87MG细胞生长抑制(70.3%vs60.1%),显著统计学差异(P<0.01,n=3);但对SphK2下调引起的U87MG细胞生长抑制抑制了无明显作用(76.0%vs.75.6%)。Gi型的G蛋白活性的抑制PTX和磷脂酶C抑制U73122,均引起缺氧条件下U87MG细胞生长的抑制,以及U87MG细胞G2/M期的周期阻滞,并且均减弱缺氧引起的U87MG细胞ERK磷酸化增加。在缺氧条件下,PTX处理组U87MG细胞与对照组相比相对细胞数分别在48 h、72 h下降了90.1%、270.6%,均有显著统计学差异(P<0.05,n=6);U73122处理组U87MG细胞与对照组相比相对细胞数分别在48 h、72 h下降了132.2%、335.6%,均有显著统计学差异(P<0.05,n=6)。并且PTX和U73122均使U87MG细胞阻滞于G2/M期,与对照组相相比G2/M期细胞分别增加了6.00%和6.40%,有显著统计学差异(P<0.05,n=3)。PTX和U73122均降低了缺氧引起的ERK的磷酸化的增加。
结论
1.两种鞘氨醇激酶均参与了缺氧条件下胶质瘤细胞生长的调控,但其分子机制不尽相同。
2.SphK1通过G蛋白偶联受体通路激活ERK进而调控胶质瘤细胞的生长。
3.SphK2对于胶质瘤细胞的生长的调节通过ERK非依赖的方式。