背景急性排斥反应(acute rejection,AcR)相关并发症仍是当前影响受体长期存活的重要障碍之一,如何诱导移植物免疫耐受进而减少甚至停用免疫抑制剂是移植界的难题,也是目前肝移植研究领域的热点。凋亡细胞及时清除与免疫耐受微环境形成密切相关。Kupffer细胞(KCs)是肝脏内专职吞噬细胞,也是清除凋亡细胞的主要吞噬细胞。既往研究证实,KCs介导的凋亡细胞清除是维持肝脏免疫耐受的重要因素,但KCs是如何介导凋亡细胞及时有效清除及诱导免疫耐受的分子机制仍不清楚。吞噬细胞表面磷脂酰丝氨酸(PtdSer)受体识别PtdSer是凋亡细胞吞噬过程中的关键步骤。新近发现PtdSer受体—清道夫受体家族F类成员1(SCARFI)在调控凋亡细胞清除过程中发挥着关键作用,且其调节作用强于既往发现的PtdSer受体。但相关研究主要集中在自身免疫性疾病方面,尚未涉及移植领域,更未涉及KCs。因此,探讨KCs介导的凋亡细胞吞噬清除在诱导肝移植免疫耐受中的作用及其具体机制,能够为防治肝移植后AcR及诱导免疫耐受提供新策略。第一部分SCARF1表达变化对Kupffer细胞免疫功能调控的作用研究目的:通过抑制或上调KCs中SCARF 1表达,观察SCARF 1表达变化对KCs吞噬功能以及细胞表型改变的影响以及机制。方法:(1)按照VI型胶原酶消化、梯度离心、选择性贴壁的步骤分离、培养大鼠KCs,并通过吞墨实验鉴定其吞噬功能;(2)将成功分离、鉴定后的KCs分为4组:SCARF1过表达组(AdV-SCARF1 group);过表达对照组(Ctrl-AdV group);SCARF1 抑制组(shRNA-SCARF1 group);抑制对照组(Ctrl-shRNA group),分别转染携带 AdV-SCARF1、Ctrl-AdV、shRNA-SCRAF1、Ctrl-shRNA基因的慢病毒;(3)运用免疫荧光检验病毒转染效率;(4)运用RT-PCR和Westren blot检测转染后各组KCs中SCRAF1转录和表达情况;(5)运用紫外光照射法,制备早期凋亡T细胞,并与转染后的各组KCs共培养;(6)运用免疫荧光检测各组KCs吞噬凋亡T细胞的情况;(7)运用流式细胞术检测细胞上清液中剩余凋亡T细胞数量;(8)运用流式细胞术检测各组M2型KCs细胞数量及共刺激分子CD86表达情况;(9)运用ELISA和RT-PCR检测各组KCs上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10以及TGF-β的转录和表达水平;(10)运用Western blot和免疫荧光检测各组KCs内JAK、STAT3以及磷酸化蛋白表达水平;(11)给予细胞松弛素B阻断KCs吞噬功能后,运用流式细胞术检测CD206阳性的KCs数量,运用ELISA和RT-PCR检测上清液中细胞因子的表达和转录,运用Western blot检测SCARF1、p-JAK、p-STAT3的表达。结果:(1)KCs形态正常、生长状况良好、贴壁情况良好,吞墨实验证明其具有正常的吞噬功能;(2)免疫荧光显示,转染48h后KCs中绿色荧光到达高峰;(3)Western blot和RT-PCR检测结果显示,AdV-SCRAF1组内SCARF1蛋白表达显著高Ctrl-AdV组,shRNA-SCARF1组内SCARF1蛋白显著低于shRNA-Ctrl组;而RT-PCR检测结果呈现相同趋势;(4)免疫荧光结果显示,AdV-SCRAF1组内PI阳性KCs数量显著高于Ctrl-AdV组,shRNA-SCARF1组内PI阳性KCs数量显著低于shRNA-Ctrl组;而流式细胞术结果显示,AdV-SCRAF1组内剩余凋亡T细胞数量显著低于Ctrl-AdV组,shRNA-SCARF1组内剩余凋亡T细胞数量显著高于shRNA-Ctrl组;(5)流式细胞术检测结果显示,AdV-SCRAF1组内M2 型 KCs 显著高于 Ctrl-AdV 组,shRNA-SCARFl 组内 M2 型 KCs 比例显著低于shRNA-Ctrl组;而共刺激分子CD86表达情况在AdV-SCRAF1组明显低于Ctrl-AdV组,在shRNA-SCARF1明显高于shRNA-Ctrl 组;(6)ELISA 和 RT-PCR 检测结果显示,AdV-SCRAF1组内IL-1 β、IL-6、TNF-α表达和转录水平显著低于Ctrl-AdV组,而IL-10、TGF-β表达和转录水平显著高于Ctrl-AdV组,shRNA-SCARF1组内 IL-1 β、IL-6、TNF-α 显著高于 shRNA-Ctrl 组,而 IL-10、TGF-β表达和转录水平显著低于Ctrl-AdV组;(7)Western blot检测结果显示,AdV-SCRAFl 组内 SCARF1、p-JAK、p-STAT3 表达显著高于Ctrl-AdV 组,shRNA-SCARF1 组内 SCARF1、p-JAK、p-STAT3 表达显著低于shRNA-Ctrl组;(8)AdV-SCRAF1组阻断KCs吞噬功能后,CD206阳性的KCs数量显著低于AdV-SCRAF1组;IL-1β TNF-α、IFN-丫的表达和转录显著高于AdV-SCRAF1,IL-10、TGF-β的表达和转录显著低于AdV-SCRAF1组;SCARF1、p-JAK、p-STAT3的表达也显著低于AdV-SCRAF1。结论:(1)过表达KCs内SCARFI可显著增加KCs对凋亡T细胞的吞噬清除;(2)过表达KCs中SCARFI可激活JAK/STAT3磷酸化信号通路,诱导KCs向M2型极化。(3)过表达KCs内SCARF1可减少KCs内IL-1 β、IL-6、TNF-α等促炎症因子的转录和表达水平,增加IL-10、TGF-β等抑炎症因子转录和表达水平。第二部分KCs中SCARF1表达变化在大鼠肝移植免疫耐受中的作用研究目的:经门静脉灌注转染AdV-SCARF1或SCARF1-shRNA及其对照的慢性毒,观察KCs中SCARF1表达变化在肝移植后免疫耐受中的作用机制。方法:(1)采用改良后的“双袖套法”建立Lewis→BN大鼠肝移植急性排斥模型;(2)受体随机分为3组(n=20只/组):SCARF1过表达组(AdV-SCARF1 group);SCARF1 抑制组(shRNA-SCARF1 group);对照组(Ctr1 group);(3)每组随机选择10只大鼠,观察各组大鼠平均生存时间和生存率,收集另外10只大鼠肝脏和血液标本用于后续实验;(4)运用全自动生化仪检测各组大鼠血清ALT、AST、TBIL水平,评估各组大鼠肝功能改变;(5)运用组织病理学检测各组大鼠肝组织病理损伤程度;(6)运用TUNEL实验检测各组大鼠肝组织内凋亡细胞清除程度;(7)运用免疫组化检测各组大鼠肝组织内M2型KCs数量;(8)运用ELISA检测各组大鼠血清中IL-1 β、IL-6、TNF-α、IL-10以及TGF-β的表达水平;(9)运用Western blot检测各组大鼠肝组织内JAK、STAT3以及磷酸化蛋白表达水平。结果:(1)AdV-SCARF1组受体大鼠平均生存时间和生存率较其余两组显著提高;(2)AdV-SCARF1组受体大鼠血清AST、ALT、TBIL水平较其余两组显著下降;(3)组织病理学检查结果显示,AdV-SCARF1组受体大鼠肝组织急性排斥表现程度较其余两组显著减轻,RAI评分也显著低于其余两组。(4)TUNEL实验结果提示,AdV-SCARF1组受体大鼠肝组织内凋亡细胞数量较其余两组显著减少;(5)免疫组化结果提示,AdV-SCARF1组受体大鼠肝组织M2型KCs数量较其余两组显著增高;(6)ELISA检测结果提示,AdV-SCARF1组受体大鼠血清内IL-1 β、IL-6、TNF-α表达水平较其余两组显著降低,而IL-10、TGF-β表达水平较其余两组显著显著增加;(7)Western blot实验结果提示,AdV-SCARF1组受体大鼠肝组织内SCARF1、p-JAK、p-STAT3表达显著高于其余两组。结论:(1)过表达KCs内SCARF 1显著延长了大鼠肝移植急性排斥模型平均生存时间,提高了大鼠肝移植急性排斥模型生存率;(2)过表达KCs内SCARF1显著减轻了大鼠肝移植急性排斥模型肝组织病理和肝功能损害(3)过表达KCs内SCARF1显著增加了移植肝组织内KCs对凋亡细胞的清除;(4)过表达KCs内SCARF1显著增加了移植肝组织内M2型KCs数量,减少了血清内IL-1 β、IL-6、TNF-α等促炎症因子的表达,增加了血清内IL-10、TGF-β等抑炎症因子的表达;(5)过表达移植肝脏KCs内SCARF1诱导肝移植免疫耐受的主要机制可能为JAK/STAT3信号通路的磷酸化激活。