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目的疟疾是由疟原虫引起的严重危害人类健康和生命安全的重大传染病,广泛流行于热带、亚热带地区,其防治深受各个国家的重视。快速而又准确地诊断疟疾,不仅可以让疟疾病人得到及时的治疗,而且还可以避免抗疟药物的滥用,对于合理治疗疟疾是必不可少的,是进行疟疾防治的关键。微流控芯片技术可以把用于疾病检测的基本操作单元集成在一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上,具有高通量,样品用量少,简单,快速等优点。本研究旨在建立基于微流控芯片技术的疟疾快速检测新方法。方法1.利用基因工程的方法,在大肠杆菌中表达恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-1的19kDa片段(MSP1-19)口红细胞结合抗原-175的F2片段(PfF2)并进行纯化；以PDMS为芯片材料制作微流控芯片,将重组抗原MSP1-19/PfF2结合在抗His-Tag抗体处理过的Protein A微球上,应用微量进样泵将微球注入到芯片的微管道内,5%BSA-PBS封闭后将恶性疟疾病人的血清(1：100稀释)注入到微管道内进行抗原抗体反应,最后注入绿色荧光标记兔抗人抗体(1:100稀释),在荧光显微镜下观察荧光强度并计算平均灰度值。2.恶性疟原虫FCR株裂殖子中提取总RNA,采用RT-PCR扩增得到总cDNA:以总cDNA为模板扩增恶性疟原虫乳酸脱氢酶(PfLDH)编码基因,将其克隆入pQE-30表达载体；转入大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,以Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并以NBT显色法检测rPfLDH的酶活性；以纯化的rPfLDH免疫BALB/c小鼠,将免疫好的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,克隆化,通过间接ELISA筛选分泌抗PfLDH单克隆抗体(McAb)的细胞株；对分泌的McAb进行亚型鉴定,并应用Affi-Gel Protein A MAPS II Kit提纯McAb:通过间接ELISA检测McAb与血液中蛋白的交叉反应性；通过间接ELISA和免疫印迹试验(Western blot)对McAb特异性和相对亲和力进行检测；应用Octet QK仪器测定McAb平衡解离常数KD。结果1.制备提纯了MSP1-19和PfF2两种抗原,纯度在95%以上；基于微流控芯片技术的血清学检测方法检测1个样品的血清用量少,用量不到1μL,其他反应试剂的用量也极大地减少,检测时间可以控制在1hr以内,结果与ELISA检测结果基本一致。2.克隆了恶性疟原虫FCR3株的乳酸脱氢酶编码基因,与GeneBank中登录的3D7株乳酸脱氢酶基因有100%的同源性；构建了pQE30-PtLDH表达载体,并在大肠杆菌中成功表达了具有酶活性的PfLDH:杂交瘤技术获得了11株可稳定分泌抗PfLDH McAb的杂交瘤细胞株,命名为1A1D9,1C3G4,1F1C4,1G6D10,2F4F7,3D10D10,4A6F3,4G11B4,5G10B4,5C2E8,6F2D9,除5C2E8为IgG2a外,其他10株为IgG1,11株抗体轻链均为K链；Western blot结果显示1C3G4,4A6F3,5G10B4,6F2D9可以与rPfLDH特异性结合,识别rPfLDH的线性表位,ELISA检测结果显示,McAb与人血液蛋白无交叉反应性;间接ELISA测得McAb相对亲和力排序为1C3G4>6F2D9>1F1C4,5C2E8>5G10B4>4G11B4>4A6F3>1A1D9; Octet QK仪器测定1A1D9、1C3G4、1F1C4、25C2E8和6F2D9的平衡解离常数KD值分别为2.04×10-10、7.88×10-12、68×10-11、2.56×10-11和9.21×10-11。结论基于微流控芯片技术的血清学检测方法简便快速,检验成本低,样品使用量少,便于自动化操作,有利于疟疾的筛查与监测；成功克隆了恶性疟原虫FCR3株的PfLDH编码基因,并在大肠杆菌中进行了高效表达,制备出了具有酶活性的PfLDH,获得了稳定分泌高亲和力的特异性PfLDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为通过微流控芯片技术检测血液中疟原虫循环抗原进行疟疾的检测奠定了基础。