论文部分内容阅读
背景和目的甲状腺乳头状癌(PTC)是最常见的甲状腺癌,并且发病率呈上升趋势。虽然大多数PTC患者通过手术和碘131治疗能够取得不错的疗效,但是有些PTC患者早期就已经发生了严重的淋巴结转移和浸润,这些PTC患者通过手术和碘131均不能达到满意的治疗效果。因此,寻找与PTC转移相关的有效靶点是PTC患者治疗的新策略。ASAP1是ADP-核糖基化因子的GTP酶激活蛋白,具有SH3、BAR、PH、GAP和ANK等多个结构域。ASAP1已被确立为肌动蛋白细胞骨架和粘着斑复合物的调节剂,在细胞运动及细胞间粘附调控等过程中有重要作用。ASAP1在多种癌组织中高表达,被认为是多种肿瘤治疗的潜在治疗靶点,通过抑制或敲除ASAP1基因,肿瘤的侵袭、迁移等生物学行为会受到抑制,从而达到治疗肿瘤的效果。我们前期工作已经发现ASAP1在PTC组织中呈明显高表达,且与临床分期有关。并且有研究指出ASAP1的SH3、PH结构域的激活可以调节自噬,促进肿瘤细胞侵袭迁移。当前,自噬作为癌症的靶向治疗方法,在癌症的治疗中发挥着重要作用。自噬在癌症中发挥着双重作用,既可以抑制肿瘤的生长也可以维持癌细胞的存活。自噬在癌症中的作用取决于肿瘤的病理类型和病理阶段,在肿瘤发生的早期阶段,自噬可能抑制肿瘤的发展;然而,在肿瘤形成后,自噬可促进肿瘤的生长。并且之前有研究表明自噬与肿瘤细胞的细胞增殖和转移密切相关,通过自噬的调节可以调节肿瘤细胞的增殖迁移。因此,调节PTC的自噬水平很可能成为PTC的一种潜在的治疗方式。本研究的目的旨在探讨ASAP1在甲状腺乳头状癌细胞自噬中是否具有调节作用及其机制。材料与方法1.收集60例PTC患者的癌组织及其癌旁组织新鲜标本,用组织免疫荧光方法检测癌组织及癌旁组织中ASAP1和自噬标志蛋白LC3B的表达量。2.选择甲状腺乳头状癌细胞株MDA-T32和MDA-T85,应用CRISPR/Cas9基因敲除技术对MDA-T32和MDA-T85细胞株的ASAP1基因进行敲除并构建细胞系。3.通过Western Blot和细胞免疫荧光方法进行检测ASAP1敲除组与对照组自噬水平的差异。结合自噬抑制剂氯喹(CQ)来验证ASAP1的敲除的确是提高了 MDA-T32和MDA-T85细胞的自噬水平而不是抑制了自噬溶酶体的降解。4.通过Western Blot检测mTOR通路活性相关蛋白(p-p70S6K,p-mTOR)的表达,初步探究ASAP1抑制甲状腺乳头状癌细胞自噬的分子机制。5.各变量的统计分析所用的软件是SPSS 21.0。图形的绘制使用GraphPad Prism8软件。t检验和卡方检验用来分析各变量之间的差异,P<0.05即差异有统计学意义。结果1.相比于癌旁组织,ASAP1在PTC组织中的表达水平升高且与患者的不良预后相关。2.相比于癌旁组织,自噬标志蛋白LC3B在PTC组织中的表达水平降低。3.敲除ASAP1使MDA-T32和MDA-T85细胞的自噬水平升高。4.敲除ASAP1能抑制mTOR信号通路。结论1.ASAP1抑制甲状腺乳头状癌细胞的自噬2.ASAP1通过mTOR信号通路来下调甲状腺乳头状癌细胞的自噬水平,这可能是ASAP1参与甲状腺乳头状癌细胞转移调控的机制之一。