论文部分内容阅读
大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）自然分布于大西洋东海岸,作为优质的海水养殖鱼类,在世界各地广泛养殖。然而,随着大菱鲆养殖产业的迅速发展,细菌性腹水症在大菱鲆养殖的苗期和养成期频繁爆发,死亡率达到80%以上,已经成为制约我国大菱鲆养殖业健康发展的一大瓶颈。传统的疾病控制措施（如使用抗生素）虽然有效,但在水产养殖中的使用逐渐受到限制,从而迫切需要寻求一种高效安全的天然抗菌剂用于养殖大菱鲆细菌性病害的防控,以期从源头解决问题。近年来,噬菌体作为抗生素和其他抗菌化合物的替代品越来越受到关注,以控制微生物疾病并防止多重耐药细菌在水产养殖中的传播。鉴于此,本论文以噬菌体制剂为研究对象,评价其对大菱鲆细菌性腹水症的防控效果,为噬菌体制剂的安全有效应用提供理论依据。从患腹水症的大菱鲆样品中分离获得3株优势菌株,分别命名为ET9、VH5和VH8。经16S rDNA测序、透射电镜观察和生理生化分析,鉴定ET9为迟缓爱德华氏菌,VH5和VH8为哈维氏弧菌。经回接感染实验证明ET9、VH5和VH8的LD50分别为6.0 × 104 CFU/尾,7.9 × 105 CFU/尾和7.8 × 107 CFU/尾。抗生素敏感实验结果显示,3株受测菌株均具有多重耐药性。以这3株菌为宿主,筛选获得3株裂解性噬菌体,分别命名为PETp9、PVHp5和PVHp8。在双层平板中均可形成透亮度较高的噬菌斑,形态学观察发现3株均属于有尾目噬菌体,PETp9、PVHp5和PVHp8分别为肌尾科、自复制短尾科和肌尾科,且对氯仿不敏感,专一性也很高。PETp9、PVHp5和PVHp8的潜伏期分别为 30 min、10 min 和 20 min,裂解量分别为 39 PFU/cell、151 PFU/cell 和 28 PFU/cell。噬菌体PETp9和PVHp5的最适pH值为4～10,PVHp8的最适pH值为pH 7～10。3株噬菌体在-20～37℃条件下均可稳定存在。PETp9和PVHp5在50℃下可保持80 min裂解活性;60℃下可保持40 min裂解活性;70℃下无裂解活性。PVHp8在50℃下可保持40 min裂解活性,60℃和70℃下无裂解活性。3株噬菌体的稳定性不受盐度的影响。将噬菌体进行应用前,应通过全基因组测序分析噬菌体基因水平的安全性。测序结果显示,噬菌体PETp9、PVHp5和PVHp8的全基因组长度分别为89,762 bp、42,485 bp和87,255 bp,GC含量分别为37.26%、45.07%和36.84%,获得的序列号分别为MN399336、MN497414 和 MN497415。噬菌体 PETp9、PVHp5 和 PVHp8 分别具有 1 32、49和150个ORFs,其中具有已知功能的ORFs分别为36、22和37个。在NCBI中全基因组序列比对发现,无已知的噬菌体与PETp9、PVHp5和PVHp8具有同源性,这表明3株噬菌体均为新型噬菌体。3株噬菌体的基因组中均未检测到与耐药和毒力有关的基因,也未发现毒力转移和溶源基因同源序列。为评估噬菌体的给药方式对防治效果的影响,本论文通过饲喂、注射和浸浴等方式,研究了噬菌体制剂对大菱鲆腹水症的防治效果。对噬菌体的吸附时间为15 min时,噬菌体效价达到最大值,随后保持稳定。大于15 min时,饲料由于吸水过多而过于松软,影响大菱鲆摄食。单一噬菌体饲喂给药时,保护效果较好的噬菌体为PETp9和PVHp5,最佳给药浓度分别为大于等于6 × 106 PFU/mL和8 × 107 PFU/mL。PETp9和PVHp5的鸡尾酒制剂MOI ≥ 10（即1:1混合浓度为6 × 106 PFU/mL的PETp9和8 × 107 PFU/mL的PVHp5）时具有较好的保护效果。腹腔注射给药和浸浴给药实验中的最佳给药时间为感染当天给药,最佳给药浓度均为MOI=100（即1:1混合浓度为6 × 107 PFU/mL的PETp9和8 × 108 PFU/mL的PVHp5）,存活率分别为67%和60%。腹腔注射给药组的治疗效果优于浸浴给药组的治疗效果,但无显著性差异（P＞0.05）。施用噬菌体期间,大菱鲆养殖水体和肠道中均可持续监测到噬菌体。饲喂给药后噬菌体在养殖水和肠道内的滴度均高于注射给药和浸浴给药组,噬菌体在肠道内的存在时间也长于注射给药和浸浴给药组。饲喂噬菌体期间,所有大菱鲆均保持着健康状态。从大菱鲆的血液指标炎症细胞因子相关基因的表达以及肠道菌群变化等方面对噬菌体的安全性进行进一步评价。健康大菱鲆经混合菌剂攻毒后,因细菌性感染而出现造血功能出现异常,大菱鲆肝脏和肾脏功能出现异常。而提前饲喂噬菌体预防组大菱鲆的血常规指标以及血清生化指标均显示正常。仅攻毒组和饲喂噬菌体后攻毒组大菱鲆血液中的LYZ、SOD、NOS及ACP含量均显著高于空白对照组,说明在混合菌剂攻毒后大菱鲆的非特异性免疫酶活性升高,但饲喂噬菌体后攻毒组的4种酶活性略低于仅攻毒组,这可能与攻毒后噬菌体饲喂组的非特异性免疫酶与提前存在于体内的噬菌体共同杀灭细菌有关。饲喂含浓度为MOI=10的噬菌体鸡尾酒组与仅攻毒组相比,大菱鲆攻毒24 h后,头肾和脾脏中的1L-1β、1L-8、TNF-α和C3的转录水平显著降低（P＜0.05）。这说明噬菌体的饲喂,可显著降低由细菌引起的大菱鲆的炎症反应。通过高通量测序对饲喂噬菌体鸡尾酒组和仅攻毒组的大菱鲆肠道菌群进行分析,结果显示饲喂噬菌体鸡尾酒可显著降低大菱鲆肠道中的弧菌属和爱德华氏菌属的丰度。综上所述,本论文为噬菌体制剂防控迟缓爱德华氏菌和哈维氏弧菌引起的大菱鲆腹水症提供了理论依据和研究基础。