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研究背景:帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,其主要病理特征是黑质（Substantia Nigra,SN）致密部多巴胺（Dopamine,DA）能神经元损伤,中脑黑质出现α-突触核蛋白（α-Synuclein,α-Syn）聚集形成的路易小体。锰是人体正常生命活动所必需的微量元素,在大脑发育、神经元功能、抗氧化防御及维持免疫完整性等多种生理过程中发挥重要作用。研究发现中枢神经系统是锰毒性的主要靶点,锰能够穿过血脑屏障,在基底神经节蓄积,使大脑神经递质发生改变,导致神经毒性。流行病学研究发现焊工的PD患病率增加,且PD样症状与含锰焊接烟雾浓度呈剂量反应关系。此外,PD患者的血锰水平升高。目前锰神经毒性的机制尚未完全阐明,氧化应激、线粒体功能障碍、神经炎症等可能在锰致病机制中发挥重要作用。维生素E（Vitamin E,VE）是一种脂溶性维生素,通过充当ROS清除剂,能够减轻线粒体功能障碍,防止神经元凋亡,表现出强大的神经保护作用。流行病学研究发现PD患者的血浆维生素E水平降低。但目前尚未有关于维生素E能否拮抗锰诱导的小鼠黑质-纹状体系统损伤的报道。研究目的:既往研究表明维生素E具有神经保护作用,然而维生素E能否改善锰诱导的小鼠黑质-纹状体系统损伤尚未有报道,本研究旨在探讨维生素E对锰诱导的小鼠黑质-纹状体系统损伤的保护作用及相应机制。研究方法:将60只8周龄C57BL/6雄性小鼠随机分为对照组（橄榄油+生理盐水）、Mncl2组（橄榄油+Mncl2）、VE组（VE+生理盐水）、Mncl2+VE组（VE+Mncl2）,每组15只。8周龄小鼠预先通过灌胃给予VE（剂量:100 mg/kg,时间:5周,每周5天）或等量的橄榄油;9周龄小鼠通过腹腔注射给予Mncl2（剂量:10 mg/kg,时间:4周,每周7天）或等量的生理盐水。首先采用转棒实验、爬杆实验检测小鼠的运动能力和肢体协调能力;采用免疫荧光染色检测SN区DA能神经元的变化;采用尼氏染色检测SN区尼氏阳性神经元的变化;采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）检测纹状体（Striatum,Str）DA及代谢产物高香草酸（Homovanillic acid,HVA）和二羟基苯乙酸（Dihydroxyphenylacetic acid,DOPAC）含量的变化;采用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察DA能神经元线粒体及细胞核形态变化,观察维生素E能否拮抗Mncl2诱导的黑质-纹状体系统损伤。进一步采用转录组分析维生素E拮抗锰诱导的小鼠黑质-纹状体系统损伤相关的信号通路,并采用RT-PCR检测信号通路中CHRM1、KCNJ4 m RNA水平,以探讨维生素E改善锰诱导的黑质-纹状体系统损伤的作用机制。研究结果:1.分别比较处理前和处理后各组小鼠的体重,结果显示处理前后各组小鼠体重变化均无差异（p＞0.05）,说明维生素E和锰暴露对小鼠体重均无影响。2.采用转棒实验检测小鼠的运动能力。与对照组相比,Mncl2组小鼠转棒停留时间缩短39.63%（p＜0.0001）;与Mncl2组相比,Mncl2+VE组小鼠转棒停留时间延长48.96%（p＜0.01）,说明维生素E能够改善锰诱导的小鼠转棒行为障碍。3.采用爬杆实验检测小鼠的肢体协调能力。与对照组相比,Mncl2组小鼠转头时间和落地时间分别延长61.44%、41.79%（p＜0.001）;与Mncl2组相比,Mncl2+VE组小鼠转头时间缩短27.79%（p＜0.05）,落地时间缩短29.37%（p＜0.001）,说明维生素E能够改善锰诱导的小鼠爬杆行为障碍。4.采用免疫荧光染色检测SN区DA能神经元的变化。与对照组相比,Mncl2组小鼠TH+神经元数目下降42.10%（p＜0.01）;与Mncl2组相比,Mncl2+VE组小鼠TH+神经元数目增加78.69%（p＜0.01）,说明维生素E能够拮抗锰诱导的小鼠黑质DA能神经元损伤。5.采用尼氏染色观察SN区尼氏阳性神经元的变化。与对照组相比,Mncl2组小鼠尼氏阳性神经元数目下降28.73%（p＜0.01）;与Mncl2组相比,Mncl2+VE组小鼠尼氏阳性神经元数目增加31.97%（p＜0.05）,说明维生素E能够改善锰诱导的小鼠神经元损伤。6.采用HPLC检测Str区DA、HVA和DOPAC含量的变化。与对照组相比,Mncl2组小鼠DA、HVA含量分别下降58.39%、54.88%（p＜0.001）;与Mncl2组相比,Mncl2+VE组小鼠DA、HVA含量分别增加148.09%、145.39%（p＜0.001）;对照组、Mncl2组、Mncl2+VE组DOPAC含量相比无差异（p＞0.05）。说明维生素E能够拮抗锰诱导的小鼠纹状体DA及代谢产物HVA含量下降。7.采用透射电子显微镜观察SN区DA能神经元线粒体及细胞核形态变化。对照组线粒体饱满、嵴清晰,Mncl2组线粒体严重空泡化、嵴消失,Mncl2+VE组线粒体空泡化得到改善、嵴可见。说明维生素E能够拮抗锰诱导的小鼠黑质DA能神经元线粒体损伤。与对照组相比,Mncl2组细胞核出现染色质固缩和边缘化,Mncl2+VE组细胞核形态得到改善。说明维生素E能够拮抗锰诱导的小鼠黑质DA能神经元细胞核损伤。8.对照组、Mncl2组、Mncl2+VE组各取6只小鼠黑质,进行转录组测序。测序共获得128.15Gb Clean Data,各样品Q30碱基百分比均不小于93.47%,GC含量稳定,与参考基因组的比对效率在95.78%～96.69%之间,说明待测样本与参考基因组比对相关性较高;样品间R~2均大于0.965,说明生物学重复好。9.对对照组与Mncl2组进行差异表达基因分析,共发现203个差异基因。其中120个基因在Mncl2组表达量升高,83个基因在Mncl2组表达量降低。对差异基因进行GO分析,在生物学过程中,差异基因在蛋白质三聚体化、干细胞分化的正调控、神经肌肉突触传递、内皮细胞凋亡过程的负调控、细胞迁移与新血管生成、上皮细胞迁移的负调控、周围神经系统发育、轴丝动力蛋白复合体、突触组织的调节方面差异最明显;在细胞组分中,差异基因在细胞外区域、突触、谷氨酸能突触、转录因子复合物方面差异最明显;在分子功能中,差异基因在序列特异性DNA结合、肌动蛋白丝结合、电压门控钾离子通道活性方面差异最明显。10.对Mncl2组与Mncl2+VE组进行差异表达基因分析,共发现309个差异基因。其中67个基因在Mncl2+VE组表达量升高,242个基因在Mncl2+VE组表达量降低。对差异基因进行GO分析,在生物学过程中,差异基因在纤毛运动、胰岛素分泌的正调控、神经肽信号通路、离子跨膜转运调控、胞浆钙离子浓度的正调控方面差异最明显;在细胞组分中,差异基因在细胞表面区域、纤毛、纤毛运动方面差异最明显;在分子功能中,差异基因在钙离子结合、序列-特异性DNA结合、蛋白质二聚体化、转录激活活性方面差异最明显。11.绘制对照组与Mncl2组、Mncl2组与Mncl2+VE组比较的差异基因韦恩图,结果显示数据之间具有重合性,81个基因是三组共有。通过KEGG数据库比对,差异基因在胆碱能突触信号通路中富集。其中,与对照组相比,Mncl2组CHRM1、KCNJ4m RNA水平上调;与Mncl2组相比,Mncl2+VE组CHRM1、KCNJ4 m RNA水平下调。提示维生素E拮抗锰诱导的小鼠黑质-纹状体系统损伤的作用可能与维生素E能够降低CHRM1、KCNJ4 m RNA水平有关。12.采用RT-PCR检测小鼠黑质CHRM1、KCNJ4 m RNA水平。与对照组相比,Mncl2组CHRM1 m RNA水平增加234.72%（p＜0.001）;与Mncl2组相比,Mncl2+VE组CHRM1 m RNA水平下降52.04%（p＜0.01）,说明维生素E能够拮抗锰诱导的小鼠黑质CHRM1 m RNA上调。与对照组相比,Mncl2组KCNJ4 m RNA水平增加162.52%（p＜0.05）;与Mncl2组相比,Mncl2+VE组KCNJ4 m RNA水平下降65.19%（p＜0.05）,说明维生素E能够拮抗锰诱导的小鼠黑质KCNJ4 m RNA上调。结论:维生素E对锰诱导的黑质-纹状体系统损伤具有保护作用;该作用与维生素E能够拮抗锰诱导的黑质CHRM1、KCNJ4 m RNA水平上调有关。