1研究背景与研究目的肾母细胞瘤是小儿最常见的腹膜后恶性实体肿瘤之一,在小儿腹部恶性实体肿瘤中的发病率居第一位,特别是在15岁以下小儿泌尿生殖系肿瘤中占有很大比例。左右侧发病数几乎相近,但双侧肿瘤发病较少,大约为肾母细胞瘤总发病率的3-10%,或同时或相继发生。男性患儿和女性患儿的发病几乎无差别,但很多研究显示男性患儿发病略多于女性。肾母细胞瘤患儿的早期症状并不明显,并且由于其发病年龄较低,患者多为小儿或婴儿,易忽视或无法描述某些体征,导致其患儿就医时间延迟。现有检查手段只适用于肿瘤具有一定体积时的患者,如：排泄性尿路造影、超声波、CT及磁共振等；目前用于肾母细胞瘤诊断的相关性标记物(包括血清乳酸脱氢酶,甲胎蛋白等)由于敏感性和特异性都较差,所以对肾母细胞瘤的诊断作用或者协助诊断作用都非常有限。以上情况决定了现在医疗手段重点侧重于对较晚期肾母细胞瘤患者的治疗(包括手术与药物化疗等)。而美国国家肾母细胞瘤研究协作组(NWTS)研究显示：无论采用哪种治疗方法,肾母细胞瘤患者的生存率都会随着其分期的升高而下降。由此可见,利用现有的实验技术寻找一种准确、简便易行的肾母细胞瘤早期检测方法以使肾母细胞瘤患儿得到更早的治疗并获得长期生存率迫在眉睫。蛋白质组学及其相关技术的发展可以满足寻找准确且简便易行的肾母细胞瘤早期检测方法这一要求。1994年,Wilkins和Williams(澳大利亚)最早提出了蛋白质组学这一概念。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征。任何的疾病在蛋白质的水平上都会产生变化,无论是量的改变还是质的改变。由此可以建立一种以监测某种疾病特异性蛋白质水平变化而达到早期诊断这种疾病目的的诊断体系,这也是现在人们对于疾病早期诊断,特别是肿瘤的早期诊断的一个重要研究方向。而寻找某种疾病与之对应的特异性蛋白质则成了这个重要研究方向的核心问题。随着蛋白质组学技术的发展,越来越多的疾病蛋白质标记物被鉴定。在筛选疾病蛋白质标记物和药物靶点中应用蛋白质组学被认为是最有效的方法之一,由此可见,其相关技术为寻找准确可行的肾母细胞瘤早期检测与筛查手段提供了可能。依托蛋白质组学中的几项重要技术：其中包括“表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)"、“基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)"、‘高效液相色谱技术(HPLC)"与“二维液相色谱-线性离子阱质谱(2D-LC-LTQ-MS)联用系统”的串联使用；通过对肾母细胞瘤患者的术前血清、术后血清及正常小儿血清中蛋白质的定性定量分析,筛选并鉴定出肾母细胞瘤患者血清中存在的特异性蛋白质或含量与正常小儿血清有差异的蛋白质,并通过蛋白质印渍技术或蛋白质芯片技术对于以上筛选及鉴定的特异性或者差异性蛋白质进行验证,即为肾母细胞瘤特异性蛋白质标记物,此特异性蛋白质标记物为肾母细胞瘤的早期临床诊断和进行下一步治疗提供了可能和参考。但是,由于癌组织或癌旁组织或能产生一些非特异性的炎症因子,使肿瘤患者血清中的蛋白质在质和量上更接近于某些炎症性疾病患者或良性疾病患者。在我们的前期工作中被鉴定出的肾母细胞瘤特异性蛋白质很有可能与以上提到的炎症性疾病或良性疾病存在着一定的相关性。由于炎症及炎症因子对肿瘤患者血清蛋白质的质和量上的干扰,使已被鉴定为肾母细胞瘤特异性蛋白质标记物的可信度和应用性大大降低。造成这种情况的根本原因是：免疫系统和免疫细胞在肿瘤的发生发展过程中起着非常关键的作用。因此,在本次筛选肾母细胞瘤特异性蛋白质标记物的工作中,我们将排除炎症及炎症因子的干扰作为其中一项重要的任务。所以本次课题的研究目的在于筛选鉴定及验证出肾母细胞瘤血清中的非炎症性蛋白质标记物。2材料与方法2.1实验材料2.1.1临床病例资料本课题选取的303例血清样本均来自于郑州大学第一附属医院小儿外科。所取血样为晨起、空腹抽取5 ml外周静脉血,4℃下静置1h,3000 r/min离心15 min,取上清液,分装于100μl/管,置—80℃冰箱保存,转运则置入液氮中。血清包括103例肾母细胞瘤患儿术前血清样本(Ⅰstage 45,Ⅱstage 28,Ⅲstage 24 andⅣstage 6(分期根据NWTS-5标准))；97例肾母细胞瘤患儿术后血清样本(均来自于以上术前患儿的术后血清,血清收集时间为术后7-14天(中位时间为11.27天))；103例正常对照小儿血清来自于体检小儿。肾母细胞瘤患儿(包括57名男性患儿,46名女性患儿)的年龄区间为2个月至183个月,其中中位年龄为39.12个月,血清标本均在初诊时获得,未经化疗、手术及介入等治疗；肾母细胞瘤术后患儿(包括53名男性患儿,44名女性患儿)的年龄区间为2个月至183个月,其中中位年龄为40.81个月；正常对照小儿(包括57名男性儿童,46名女性儿童)年龄区间为3个月至194个月,其中中位年龄为44.31个月。本实验选用的肾母细胞瘤病理类型均为预后良好性(FH),但不包括囊性部分分化型肾母细胞瘤(CPDN)。以上有关病理部分的内容均经过两位以上的病理学专家的证实。本实验经本院伦理委员会同意,且受试者均签署有知情同意书。2.1.2炎症因子的选择通过对于以往研究中炎症因子与肿瘤相关性的分析,发现多种炎症因子的表达水平在肿瘤患者血清中都有一定的波动。本课题选择了与肿瘤关系较密切,文献中报道较多的一些炎症因子,将其质谱图与筛选出的肾母细胞瘤特异性蛋白质峰值比较,排除相同或类似的峰值,以期排除炎症及炎症因子在筛选肾母细胞瘤特异性蛋白质标记物中的干扰。其中与乳腺癌,肝细胞癌,胰导管腺癌,肾细胞癌骨转移相关的CC家族的巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α,MIP-1β,MIP-3α, MIP-3β以及CXC亚族的白细胞介素(IL)-10,γ干扰素可诱导蛋白(IP)-10,γ干扰素诱导单核因子、在肾细胞癌中高表达的IP-10,γ干扰素诱导单核因子(MIG), MIP-1α,RANTES蛋白、与结肠癌和口腔癌有关的IL-1,IL-6和TNF-α、与卵巢癌有关的IL-10、与口腔鳞状上皮细胞癌有关的血管内皮生长因子(VEGF)都作为实验对象,用于排除这些炎症因子在筛选肾母细胞瘤血清蛋白标记物时对寻找特异性蛋白的干扰。2.1.3主要试剂及仪器乙腈(HPLC grade)等主要实验试剂来自于美国Sigma公司,鼠抗人血清(antiserum SAA1,一抗)、兔抗人血清(antiserum apoC-Ⅲ,一抗)、抗鼠血清(二抗)、抗兔血清(二抗)均来自于美国santa cruz biotechnology公司,所有用于与特异性蛋白质峰值进行比对的炎症因子均来自于美国PeproTech公司。用于筛选特异性蛋白质峰值和测定炎症因子质谱峰值图的的PBSⅡ+型SELDI-TOF-MS及Bio-processor:弱阳离子交换芯片(WCX)2蛋白质芯片工作平台来自于美国Ciphergen Biosystem公司,用于分离纯化血清样品中蛋白质的HPLC来自于日本Shimadzu公司,其中色谱柱：C18(250*4.6mm)来自于德国Sunchrom公司,用于鉴定肾母细胞瘤血清非炎症性蛋白质标记物的MALDI-TOF-MS系统来自于英国Kratos Analytical公司、2D-LC-LTQ-MS系统来自于美国Thermo Electron公司,用于Western Blot技术的Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System和Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell来自于美国Bio-Rad Laboratories公司。2.2实验方法2.2.1肾母细胞瘤血清中蛋白质及炎症因子峰值的测定冰(水)浴上缓慢融解血清并离心；将10μl U9血清处理液以微量加样器加入血清5μL中,充分混合可使用摇床振荡(600rpm,4℃,30分钟)；U9处理后的血清以Binding Buffer稀释至200μl,其稀释液用于上样,充分混合依然利用摇床振荡(600rpm,4℃,2分钟)。芯片装入96孔蛋白质芯片工作支架Bio-processor中,记下芯片号；每孔中加入200μl与芯片相对应的Binding Buffer, 50mM乙酸钠(pH=4.0),充分平衡是利用摇床上振荡(600rpm,室温)5分钟处理后去除液体,重复平衡一次。血清100μl经U9处理过后加到芯片上。充分反应时间为1小时。200μl相应的Binding Buffer被加入到每个孔中,5分钟的摇床振荡(600rpm,室温)后除去液体。重复该过程2次。每个孔都需要用纯度HPLC级水清洗1次,甩干后将以清洁的吸水纸覆盖并将Bio-processor倒扣在其上。Bio-processor中的芯片取出后,需要自然干燥。50%饱和的SPA溶液1μl被加入到每个孔中,自然干燥后需要再次加上述液体1次。自然干燥即可上机检测。炎症因子同前方法加样。2.2.2数据分析及统计学处理过滤噪音是数据处理的第一步,其次需要聚类分析处理,再次是Wilcoxon秩和检验,对像是初步筛选出的m/z峰,最后需要对不同组别质谱数据进行f检验。检验标准a=0.01；肾母细胞瘤术前组、术后组及正常对照组间的差异性峰值进行分析比对,找出术前组(即肾母细胞瘤患者)与其他两组差异性较大的蛋白质峰值；将炎症因子的峰值与已筛选出的差异性蛋白质峰值进行比对,将两组中相同或相似的峰值归类,不同的峰值另归类。2.2.3肾母细胞瘤血清非炎症性标记物的纯化根据SELDI-TOF-MS筛选结果,选取质荷比位于11526 Da及4756 Da的蛋白质或肽段表达量较高的血清作为分离纯化样本。冰水浴解冻,抽取血清样本100μl。以每100μl血清加入300μl超纯水及300μl ACN,用于沉淀对结果可能造成影响的大分子高丰度蛋白质,吹打后静置于4℃环境5min。离心后,吸取上清液,弃去沉淀。将上清液置入SPD SpeedVac冻干至100μl。高效液相色谱仪输液泵中A液：95%超纯水,5% ACN,0.1%TFA;B液：95%ACN,5%超纯水,0.1%TFA。分别以B液,A液冲洗C18色谱柱各15分钟。设置高效液相色谱仪数据总流速为1ml/min,时间梯度变化数据为：(100%A/O min)-(20%B/ 15 min)-(40%B/30 min)-(70%B/80min)-(100% B/100 min).加样后对分离纯化出的每一个蛋白质峰以不同的eppendorf(EP)管收集。将EP管置入SPD SpeedVac中冻干至20μ1。2.2.4肾母细胞瘤血清非炎症性标记物的鉴定将冻干后的蛋白质样品置入MALDI-TOF-MS进行蛋白质质荷比的检测,找出与前期SELDI-TOF-MS技术筛选的非炎症性差异性蛋白质相同或相似质荷比的蛋白质所在的样本。将C18填料填入毛细柱,制备成蛋白质样品检测的梯度洗脱柱。将待测酶解后的蛋白质样品用高压气体加入样品柱,并保持加样中的适当流量。将加样后的样品柱与梯度洗脱柱与2D-LC-LTQ-MS系统的喷雾系统串联,进行肽质荷比图谱的检测。结果导入SEQUEST检索程序并在Bioworks数据库检索和结果肽段及氨基酸匹配的可能蛋白质。2.2.5肾母细胞瘤血清非炎症性标记物的验证融解血清依然需要在冰浴上进行(30-60分钟),然后是离心参数设置为10000rpm,5分钟(4℃)；取上清,每例样本取血清10μl。制作蛋白质电泳所用的分离胶和浓缩胶后,以恒压103V进行,以电泳溴酚兰刚跑出凝胶外为电泳终点。将胶板两边的玻璃板与凝胶分离,并对照内参将对应于目的分子量的蛋白质条带切下；以三层滤纸-PVDF膜-凝胶-三层滤纸的方式叠加,以恒压20V,5分钟进行半干转转膜。经过抗原抗体免疫反应以及化学发光与显影定影后,得到目标蛋白质的负片。负片扫描后,利用image pro plus 6.0软件对每张负片蛋白质条带的灰度值都进行测定,并对灰度值按术前组、术后组与正常对照组进行分组,利用SPSS,version 13.0软件统计各组间的灰度值有无统计学差异。3结果3.1肾母细胞瘤血清标记物的筛选将前述血清样本分组检测蛋白质峰值(术前组,术后组及正常对照组),并通过组间对照及Wilcoxon秩和检验(P<0.01)将差异性蛋白质峰值筛选出来,其中：术前组血清与正常对照组血清中筛选出17个差异性蛋白质峰值,并有16个蛋白质峰值在术前组中高表达,1个蛋白质峰值在正常对照组中高表达；术前组血清与术后组血清中筛选出14个差异性蛋白质峰值,并有9个蛋白质峰值在术前组中高表达,5个蛋白质峰值在术后组中高表达。将以上两组差异性蛋白进行对比,筛出质荷比位于11526 Da和4756 Da的蛋白质或肽段在术前组与正常对照组、术前组与术后组的分别比较中均有差异,并且都是在术前组中高表达。但两个蛋白质峰值在对照组与术后组中均无组间差异。3.2与肿瘤相关的炎症因子峰值测定炎症因子分别加样,测定的炎症因子峰值图中的峰值包括炎症因子蛋白质的峰值及其分解的肽段峰值。3.3炎症因子的峰值与已筛选出的肾母细胞瘤血清标记物对比统计炎症因子带一个或多个电荷的峰值及其分解下来的肽段峰值,并与前述术前组血清与正常对照组血清中筛选出17个差异性蛋白质峰值；术前组血清与术后组血清中筛选出14个差异性蛋白质峰值进行对比,确认无相同或者相似的蛋白质峰值。在一定程度上排除了炎症因子对于筛选肾母细胞瘤特异性蛋白质标记物的干扰,确定了肾母细胞瘤非炎症性蛋白质标记物的质荷比为11526Da和4756 Da。3.4肾母细胞瘤血清非炎症性标记物的纯化及鉴定经HPLC分离纯化后的蛋白质分别收集入EP管,使用MALDI-TOF-MS技术对每一个分离出的蛋白质的质荷比进行检测,根据MALDI-TOF-MS蛋白质质谱图找出质荷比为11526 Da及4756 Da蛋白质或肽段样品。将检测出的质荷比为11526 Da及4756 Da的蛋白质或肽段样品分别酶解及通过2D-LC-LTQ-MS系统检测肽段。通过将质荷比为11526 Da的肽段导入SEQUEST检索程序并在Bioworks数据库检索,此肽段为血清淀粉样蛋白A1(SAA1)的一个肽段；通过将质荷比为4756 Da的肽段同上方法检索,此肽段为载脂蛋白C-Ⅲ(APOC-III)的一个肽段。3.5肾母细胞瘤血清非炎症性标记物的验证Western blot试验中对于肾母细胞瘤血清术前组、术后组及正常对照组中SAA1及APO C-III的测定方法相似：首先通过测定同一凝胶板上的三组目标蛋白质条带灰度值；通过测定多块凝胶板上三组血清中目标蛋白质条带的灰度值,对三组血清中目标蛋白质条带灰度值进行统计学分析,结果为肾母细胞瘤血清术前组与术后组SAA1及APO C-III蛋白质灰度值有统计学差异；肾母细胞瘤血清术前组与正常对照组SAA1及/APO C-III蛋白质灰度值(蛋白质含量)亦有统计学差异(p<0.05)。4结论通过本研究证实了质荷比为11526 Da及4756 Da蛋白质或肽段为SAA1及APO C-III,这两种蛋白质的表达量在肾母细胞瘤患儿术前组血清与术后组血清、术前组血清与正常组血清中均具有差异性；并且在此次研究中排除了一部分与肿瘤相关的炎症因子对寻找肾母细胞瘤标记物的干扰,使得到的这两个拟作为肾母细胞瘤非炎症性蛋白质标记物的蛋白质更具有特异性。通过本课题的研究,不仅得到了特异性更强的肾母细胞瘤非炎症性蛋白质标记物,更验证了通过这一实验思路和技术流程来鉴定肿瘤蛋白质标记物的可行性,为鉴定其他肿瘤的具有更高特异性的蛋白质标记物奠定了基础。