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目的:
应用代谢组学方法分析糖皮质激素性高眼压模型兔的房水代谢物的变化,并评估口服甘草甜素对高眼压的拮抗作用。
方法：
1.兔房水中可的松、皮质醇及皮质酮的定量分析:12只雄性健康新西兰白兔,分为3组:对照组,玻璃体腔内注射0.1 ml必施眼内灌注液；曲安奈德高眼压模型组(TA组),玻璃体腔内注射0.1 ml/4 mgTA；地塞米松高眼压模型组(DEX组),隔日(共15次)球结膜下注射0.1 ml/0.5 mg DEX。在注射前(所有组)、注射后第24天(对照组和TA组)和29天(DEX组)抽取房水,应用超高效液相色谱-质谱联用技术检测兔房水中可的松、皮质醇以及皮质酮含量。在注射前、注射后1天、1周、2周、3周和4周检测眼压。
2.糖皮质激素性高眼压模型兔的房水代谢物变化的检测:动物分组同前。抽取房水时间为注射前(所有组)、注射后第1和24天(对照组和TA组),第29天(对照组和DEX组)。应用核磁共振氢谱检测和主成分分析技术进行房水代谢物分析。在注射前、注射后1天、1周、2周、3周和4周观测眼压。在注射前、注射后1周、2周和29天检测并记录闪光视网膜电流图(FERG)的暗适应反应(视杆细胞反应、最大反应和振荡电位)、明适应反应(视锥细胞反应和30Hz闪烁反应)和闪光视觉诱发电位(FVEP)的振幅和潜伏期。
3.口服甘草甜素对兔糖皮质激素性高眼压的拮抗作用:12只雄性健康新西兰白兔,分为3组:对照组和TA组(造模方法同前)；TA+口服甘草甜素拮抗组(TA+GL组)。在注射前、注射后1和24天抽取3组房水,进行核磁共振氢谱检测和主成分分析。在注射前、注射后1天、1周、2周、3周和4周测量眼压；在注射前、注射后1周、2周和24天,测量FERG的暗适应反应和明适应反应,以及FEVP的振幅和潜伏期。
结果：
1.兔房水中可的松、皮质醇及皮质酮的定量分析:注射后第1天起,TA组眼压较对照组明显上升(36.6+4.1 mmHg,P＜0.01)；首次注射后2周起,DEX组眼压较对照组明显上升(20.7±3.6 mmHg,P＜0.01)；均持续到随访结束,造模成功。在采用超高效液相色谱-质谱联用技术所建立的标准曲线中,可的松、皮质醇在0.16～100 ng/mL的浓度范围内线性良好(r＞0.998),检测灵敏度(最低检测下限)均为0.16 ng/mL,皮质酮为10 ng/mL。在房水检测中,有3个样品出现痕量,所有样品的含量均低于最低检测下限。
2.糖皮质激素性高眼压模型兔的房水代谢物变化的检测:注射后第1天起,TA组眼压较对照组明显上升(37.4±3.5 mmHg,P＜0.01)；首次注射后2周起,DEX组眼压较对照组明显上升(21.9±3.0 mmHg,P＜0.01)；造模成功。注射后第1天,TA组房水中三大营养物质代谢(糖类、脂类和蛋白质)、急性期反应蛋白和抗氧化剂的浓度较对照组发生了明显变化；在注射后第24天,只有糖类、胆碱(脂类)和抗氧化剂的浓度产生变化；在首次注射后第29天,DEX组除丙氨酸和乳酸的变化不同外,其余代谢物的变化趋势与TA注射后第1天相同。比较TA(第24天)与DEX组的频谱,糖类、急性期反应蛋白和抗氧化剂的浓度变化有差异。注射后,TA组FERG的各项指标的振幅较其它组明显下降、潜伏期明显延长(P＜0.01)；在注射后第29天,FEVP的振幅较其它组明显下降、潜伏期明显延长(P＜0.01)。
3.口服甘草甜素对兔糖皮质激素性高眼压的拮抗作用:注射后第1天起,TA组眼压较对照组明显上升(37.3±3.7 mmHg,P＜0.01)；在随访中,TA+GL组的眼压值虽较TA组有所下降,但差异未达到统计学意义(P＞0.05)。比较两组的代谢频谱,可以发现脂类、抗氧化剂和糖类的浓度出现差异。注射后,TA+GL组FERG各项指标的振幅较TA组上升、潜伏期缩短(P＜0.05)；在注射后24天,TA+GL组FVEP的振幅较TA组上升、潜伏期缩短(P＜0.05)。
结论：
1.采用超高效液相色谱-质谱联用技术可建立同时测定兔房水中可的松、皮质醇和皮质酮含量的方法,其灵敏度高,线性关系好。
2.通过核磁共振氢谱检测和主成分分析,发现不同的糖皮质激素(曲安奈德和地塞米松)诱导的兔高眼压模型之间和同一激素诱导的不同时程之间(曲安奈德注射后第1天和24天)都存在房水代谢物浓度的差异(涉及脂类、蛋白质、急性期蛋白、抗氧化剂和糖类)。提示曲安奈德和地塞米松的眼内代谢途径的差异主要是糖类代谢。
3.曲安奈德诱导的高眼压模型兔口服甘草甜素片后,各个观察点的眼压值虽较未口服组有所下降,但差异均未达到统计学意义。电生理结果显示口服甘草甜素片能拮抗曲安奈德导致的各项指标变化。比较两组的房水代谢物图谱,证实口服甘草甜素片能改变注射曲安奈德后的眼局部代谢(涉及脂类、抗氧化剂和糖类)。
4.代谢组学分析技术客观、准确、可行,可用于眼科疾病研究和局部药物疗效评估。