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目的筛选出具有对原代白血病细胞高度杀伤效率的第三方健康志愿者的双阴性T淋巴细胞,初步临床研究预防性DNT细胞输注在异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗髓系高危恶性血液病患者中的安全性及疗效。方法实验分两部分,第一部分:DNT淋巴细胞体外分离纯化扩增培养及杀伤效率实验,抽取第三方健康志愿者外周血分离并体外扩增培养DNT细胞后,分别对髓系白血病细胞株及干细胞移植后复发患者原代细胞进行体外杀伤实验;第二部分:临床研究DNT细胞预防性治疗在allo-HSCT后髓系高危恶性血液病患者中的安全性及有效性,注册单中心临床研究,观察入组患者DNT细胞治疗后的安全性及有效性,监测体内DNT变化的情况。结果第一部分:经过17-20天的体外扩增后平均每毫升外周血可得到0.5×108个DNT细胞,其纯度为>90%。所得的双阴性T细胞对髓系白血病细胞株具有较明显的杀伤作用,对AML3、MV-411、U937细胞株在效靶比为4:1的条件下其杀伤率分别为:88.59±3.10%、92.01±0.6%、97.94±0.56%。应用不同健康供者DNT细胞对5例原代细胞进行杀伤,结果显示DNT细胞对原代白血病细胞杀伤率有所下降,且同一DNT细胞对不同患者原代细胞杀伤率不同,对DNT细胞不敏感者杀伤率<10%甚至无反应,根据扩增及杀伤实验结果初步建立“供者库”。第二部分:本研究符合中国注册临床试验伦理委员会所制定的伦理标准,得到该委员会的批准,同时注册临床试验(注册号:Chi CTR1900023499);并征得受试者的知情同意,入组前均已签署知情同意书。入组3例AML患者均为allo-HSCT后复发经治疗后再次完全缓解,3例患者完成第三方供者DNT细胞回输共7人次,均未发生严重不良事件(SAE)。3例患者治疗过程及回输后肝肾等脏器功能正常,输注后30天内均未发生GVHD。治疗过程中均出现血象异常,表现为中性粒细胞及血小板减少,考虑为化疗药物所致的细胞毒性,回输后2~3周内造血系统恢复至治疗前水平。1号受试者输注细胞在体内持续增殖,14d达到高峰,回输后24d体内双阴性T细胞仍可维持一定水平。3例患者回输细胞后供者细胞均在48h达到高峰此后逐渐下降。1例患者入组时存在手指及腕关节僵硬、活动度差,考虑为移植后慢性GVHD,于输注细胞前一天停用免疫抑制剂,28d后手部排异症状明显改善。结论1.本研究通过加拿大多伦多大学Dr.L Zhang及其团队研发的DNT细胞培养专利技术,成功分离并体外扩增DNT细胞,纯度>90%,满足临床治疗剂量;DNT细胞对髓系白血病细胞株具有明显杀伤作用,对患者原代白血病细胞杀伤作用有所降低且个体杀伤效果差异较大,且存在对DNT细胞高度敏感和耐受的AML样本;DNT细胞可能部分通过NKG2D和DNAM-1发挥对白血病细胞的杀伤作用。2.Allo-HSCT后的髓系恶性血液病患者预防性输注健康供者来源的DNT细胞是安全可行的,输至人体后细胞可进一步增殖;DNT细胞可能在降低GVHD方面具有潜在的有效性,但由于本研究样本量较少需进一步招募受试者加以验证。