植物的生长发育很容易受到环境因素的影响,其中高温(热)条件是一种很常见的,对植物影响很大的非生物胁迫因素。环境温度过高时,会引起植物的缺水枯萎甚至死亡,也会导致主要农作物减产等一系列不良影响。因此,在现代生物技术的支持下,通过基因工程手段定向改善提高植物的抗逆能力,以及减少高温对植物的生长、发育和产量等造成的损害具有重要的研究价值和实践意义。本文首先通过生物信息学方法分析筛选到了可能对马铃薯耐热性有正向效应的3个磷转运蛋白(PTs)基因,并在拟南芥、烟草和酵母中进行了功能鉴定。然后利用农杆菌介导的马铃薯转化方法,分析了这3个基因分别对马铃薯耐热性的影响。最后通过对一些相关生理指标的检测,以及利用酵母双杂技术和双分子荧光互补(BIFC)技术筛选互作蛋白,初步探索了这3个PTs提高马铃薯耐热能力的生理生化机制和分子机制。主要结果如下:(1)马铃薯蛋白数据库中总共有22个PTs被鉴定出来,并可以分为6个亚家族。通过对其基因/蛋白性质、基因复制事件等分析发现,PHO1亚家族的蛋白序列最长,分子量最大,GO注释显示该家族是必需的膜组分,是唯一的亲水蛋白家族,同时PGSC数据库得到的转录本数据以及定量实验都表明该家族的St PHO1.1,St PHO1.2和St PHO1.3(合称为St PHO1s)对马铃薯的耐热性有影响。(2)构建St PHO1s的过表达p BI121载体和p YES2酵母表达载体,使其分别导入拟南芥和注射烟草,以及转化酵母。接着通过耐热实验,发现随着St PHO1s和p BI121或p YES2重组质粒的转入,拟南芥、烟草和酵母的耐热能力都有了一定的提高,这说明St PHO1s对提高耐热能力确有重要作用。(3)将St PHO1s的过表达重组质粒导入四倍体野生型马铃薯“Desiree”中,成功得到了3个基因的转基因马铃薯植株:St PHO1.1-Desiree、St PHO1.2-Desiree和St PHO1.3-Desiree。耐热实验表明,在营养充足时,转基因植株(尤其是St PHO1.2-Desiree和St PHO1.3-Desiree)在高温胁迫下的表型要优于野生型,表明过表达St PHO1s对提高马铃薯耐热性也有重要作用。(4)相关指标的检测表明,转基因马铃薯的POD、CAT和APX活性要明显高于野生型,可溶性糖含量也明显多于野生型。St PHO1.1-Desiree和St PHO1.3-Desiree中的叶绿素a和b以及类胡萝卜素含量均高于野生型植株,但St PHO1.2-Desiree的三种叶绿体色素含量和野生型相比几乎没有变化,且3个基因的转基因植株的光合速率、脯氨酸含量和相对电导率(REC)都没有明显优势。同时对和抗坏血酸合成、光合作用、抗氧化作用、蔗糖和Pro合成相关的14个基因进行定量分析发现St PHO1.1-Desiree中,PSII、P5CS1、P5CR、DHAR1、Ca2和Glu的表达量,和P5CR、SPS和Glu在St PHO1.3-Desiree中的表达量都有一定的升高,而所有基因在St PHO1.2-Desiree中的都是下调表达,结合生理指标检测说明St PHO1s对马铃薯的影响是多方面。(5)对St PHO1s的亚细胞定位结果表明,三个基因都主要表达在细胞膜上,同时细胞核或细胞质中也有少量表达。使用酵母双杂技术从拟南芥文库质粒中筛选到了多个互作基因/蛋白,并在马铃薯中匹配到了相应基因/蛋白。通过共转酵母“一对一”鉴定,筛选得到了几个重要的互作基因/蛋白,包括和抗氧化有关的谷氧还蛋白(Glu,与St PHO1.2互作)和红素氧还蛋白(Rub,与St PHO1.3互作),和光合作用有关的蛋白PSII(与St PHO1s都互作),和钙离子转运有关的蛋白Ca2(与St PHO1s都互作),以及热激蛋白40家族的成员DNAJ(Hsp,与St PHO1.1互作)。然后,本研究选择和St PHO1s都互作的Ca2和PSII,以及和St PHO1.1互作的Hsp做亚细胞定位和BIFC验证。结果显示,Hsp,Ca2和PSII定位在细胞膜和细胞质中,且St PHO1.1和Hsp(DNAJ)的相互作用,Ca2和PSII与3个基因的相互作用都发生在细胞膜和细胞质上。综上所述,马铃薯基因组中含有22个PTs,分为6个亚家族。其中,PHO1亚家族的St HO1.1,St PHO1.2和St PHO1.3对提高植物耐热性有重要作用。生理指标检测和互作蛋白筛选表明,这三个基因提高植物耐热性可能是通过提高抗氧化酶活性、可溶性糖含量以及与和光合、钙离子转运有关蛋白互作而实现的。另外,热激蛋白是一类对植物抵御高温胁迫十分重要的蛋白家族,而St PHO1.1和Hsp40家族成员DNAJ的互作亦说明了St PHO1.1也可能通过和DNAJ的相互作用,调控一系列其它生理生化反应,从而提高植物耐热能力。