论文部分内容阅读
羧甲基赖氨酸（Nε-carboxymethyllysine,CML）是美拉德反应中晚期糖基化终末产物（Advanced Glycation End-products,AGEs）的重要成分。CML通过食品介质进入人体后,可积聚于多个不同的组织器官中,达到一定数量后,会直接影响组织器官的功能,导致机体病理的变化。本论文从建立CML的检测方法入手,研究了CML在食品中的形成规律和水果多酚对其抑制的作用机理。主要研究内容与结果如下:建立了基于超高效液相色谱-串联质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS）的CML检测方法。本方法采用混和阳离子交换（Mixed Cation-e Xchange,MCX）固相萃取柱净化,以0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相对亲水作用色谱（Hydroph ILIC interaction chromatography,HILIC）柱进行梯度洗脱,在电喷雾正离子（Electro Spray positive Ions,ESI+）模式和多反应器监测（Multiple Reaction Monitoring,MRM）模式下进行CML含量的检测。本检测方法的加标回收率为87.65%-94.37%,相对标准偏差（Relative Standard Deviation,RSD）为4.83%-7.21%。检出限（Limit of Detection,LOD）为0.038 ng/m L,定量限（Limit of Quantification,LOQ）为0.127 ng/m L;重复性试验和平行性试验的RSD分别为1.64%和4.70%。应用该方法检测不同反应时间下,葡萄糖-赖氨酸模拟反应体系中的CML含量,并发现在一定条件下,体系中CML含量随反应时间的延长而增大。本方法不但操作简便,而且准确度高,灵敏度好和精密度高。研究了油炸工艺条件和水果多酚对全粉薯片中CML含量和感官指标的影响。结果表明,油炸工艺条件对全粉薯片的CML含量影响显著;CML的含量与感官综合评分呈高度正相关,当CML的含量较高时感官综合评分的相应较高。全粉薯片中分别添加0.01%-0.05%的葡萄多酚、苹果多酚或山楂多酚时,其对CML的形成均有不同程度的抑制作用,CML抑制率均随水果多酚添加量的增加而增大。在感官指标方面,较低添加量的水果多酚对油炸全粉薯片的色泽几乎没有影响,较高添加量对色泽有显著的影响;对质地、滋味与气味基本无影响。CML抑制率与油炸全粉薯片的色泽评分高度负相关,CML抑制率增大时,色泽评分会降低;而与质地、滋味与气味没有相关性。采用响应面分析法（Response Surface Methodology,RSM）考查了反应温度和反应时间,对还原糖-赖氨酸模拟反应体系中CML含量的影响。研究了初始p H值、反应温度和反应时间等单因素对反应体系中CML含量的影响。初始p H值与CML含量呈正相关;而反应温度和反应时间对CML含量的影响较为复杂,呈先增大后减小的趋势。通过比较还原糖（果糖、半乳糖或葡萄糖）-赖氨酸模拟反应体系形成CML的规律发现,果糖-赖氨酸反应体系中CML的含量最高,其次是半乳糖,最后是葡萄糖。在底物浓度为0.3 mol/L和初始p H值为7.0的条件下,采用RSM得到在反应温度分别为100.58℃、125.24℃和123.24℃,反应时间分别为30.00、24.66和25.38 min时,果糖、半乳糖和葡萄糖-赖氨酸模拟反应体系中CML的含量最高,分别为2.11、1.39和1.34 mmol/（mol赖氨酸）。研究了表没食子酸儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate,EGCG）、莞知母宁（Mangiferin,M）和槲皮素（Quercetin,Q）3种水果多酚单体对葡萄糖-赖氨酸模拟反应体系中CML的抑制作用效果和动力学作用规律。结果表明,当水果多酚单体添加量在1.0%-20.0%范围内增加时,其对CML的抑制率也相应增加,但当添加量大于10.0%时,CML抑制率随添加量的增速变小。水果多酚单体在中性和碱性条件下对CML的抑制率大于酸性条件。当在添加量为10.0%、初始p H值为7.0和反应温度为125.0℃的条件下,反应时间从10.0 min到50.0 min延长时,EGCG、M和Q对CML的抑制率在30.0min时均达到最大值,分别为（84.21±1.70）%、（76.5±1.14）%和（66.73±1.06）%。水果多酚单体对CML的抑制动力学规律表明,其对CML的形成过程具有抑制作用而对分解过程无影响。研究了葡萄糖-赖氨酸模拟反应体系中绿原酸（Chlorogenic acid,CA）、芦丁（Rutin,R）、异槲皮苷（Isoquercitrin,IQ）、槲皮素（Quercetin,Q）、表儿茶素（Epicatechin,EC）、儿茶素（Catechin,C）、表没食子儿茶素（Epigallocatechin,EGC）、表没食子酸儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate,EGCG）和莞知母宁（Mangiferin,M）共9种水果多酚单体的分子结构与CML抑制率之间的关系。结果表明,水果多酚单体对CML的抑制率的大小顺序为:EGCG>M>Q>IQ>R>EGC>C>EC>CA。其中黄酮醇类化合物对CML的抑制率顺序为:Q>IQ>R;黄烷醇及衍生物对CML的抑制率顺序为:EGCG>EGC>C>EC;氧杂蒽酮类化合物M表现出了良好的抑制效果,CML抑制率仅低于EGCG;酚酸类化合物CA的CML抑制率最低。黄酮醇Q分别与葡萄糖和芸香糖成苷生成IQ和R后,苷元分子结构的不同造成CML的抑制率有不同程度的降低;对同一结构类型的黄烷醇类多酚研究发现,其对CML的抑制率与酚羟基的数目呈正相关;数目相同时,抑制率与位置相关。氧杂蒽酮、黄酮醇与黄烷醇对比研究发现,C-环的△2（3）双键、4位羰基和π键共轭对CML的抑制率具有积极的影响。可以看出水果多酚单体对CML抑制效果的差异与分子结构、糖苷种类、酚羟基数目与位置及C-环结构等存在相关性。本论文建立了基于UPLC-MS/MS检测系统的定量检测CML含量的方法,探究了CML在食品中的形成规律,考察了模拟反应体系中水果多酚单体对CML的抑制作用规律,阐明了水果多酚分子结构与CML抑制率之间的构效关系。本论文的研究成果为水果多酚抑制食品加工中CML的形成提供了科学依据,对于有效降低食品中CML的暴露量、提高食品品质及安全性具有一定的现实意义。