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目的:
检测肝豆状核变性(Wilson desease, WD)基因启动子区的多态和突变,从分子水平进一步阐述WD的发病机制,并丰富WD的基因诊断谱。
方法:
1.实验对象:2005.11~2005.12检测28个WD家系70名成员(其中60例WD患者)及10名正常人的基因组DNA启动子序列,进行分析。
2.PCR扩增:50μl反应体积中包含基因组DNA约1600ng,引物各0.5μmol/L,dNTP各200μmol/L,Tris·Cl(PH=8.5)20μmol/L,KCl50mmol/L,MgCl2 2mmol/L,TaqDNA聚合酶(美国Promega公司产品)1.5u。PCR采用热启动法,反应在美国MJ Reasearch热循环仪中进行,扩增条件为:94℃预变性4分钟;94℃60秒变性,65℃45秒退火,72℃90秒延伸,共35个循环;72℃延伸10分钟结束反应。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,采用DNAMarkerF对照,粗测PCR产物片断大小。
3. PCR产物自动测序:PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,用基因公司QIAquick Gel Extraction 试剂盒回收扩增片段,采用PE公司的BigdyeTM terminator Cycle Sequencing Reaction 试剂盒及在ABI-3730型自动DNA测序仪上进行测序,具体操作步骤按PE公司介绍的操作指南。
结果:
1.PCR结果:PCR扩增出含WD基因启动子区、1号外显子的DNA片段长度约1500bp。
2.将所有正常对照全长启动子区的测序结果输入计算机,用DNAtools和DNAclub软件分析得出以下结果:
2.1.启动子长度都为1388bp,AT含量为35.4%,GC含量为64.6%。
2.2.存在的基因转录调控元件:①转录调控因子结合位点:Sp1、Ap1、Ap2、HNF1、HNF3、CTF、NF1、C/EBP;②应答元件:4个金属应答元件(MRE)和6个类金属应答元件(MLS,MRE-like sequence);③顺式作用元件:CAATbox、Gcbox、E-box。
2.3.2个12bp的正向重复顺序:GGCACGGCAGAG。
2.4.在正常对照、患者一级亲属和WD患者的启动子区-190、-78均发现存在单个碱基的不同,即多态;在60例病人中发现2例存在-782位A→G突变,其中2例为纯合突变,另1例为杂合突变;发现2例存在-504位G→C突变, 其中1例为纯合突变,另1例为杂合突变,在正常对照、患者一级亲属中未发现此改变。
结论:
1.启动子区在调控WD基因转录活性中起重要的作用,提示启动子区的突变是WD的分子发病机制之一。但这种突变是否影响启动子区的调控基因转录的功能需进一步的研究。
2.本研究发现的核苷酸多态位点均位于已知的转录调控元件结构之外,现代分子生物学研究证实调控元件之间的序列改变对启动子的功能没有影响,故核苷酸多态对启动子调控WD基因的表达不会产生影响。但是多态位点是否位于尚未知的转录调控元件使某种转录调控蛋白与之结合受到影响,是否影响启动子活性的改变,需进一步研究。
3.由于WD基因启动子区发现了金属巯蛋白基因的启动子序列是一致的的MLS和MRE序列,故MLS和MRE序列很可能是金属依赖性转录调控因子的结合位点,在调控WD基因转录活性中有着重要作用。在启动子区发现4个金属应答元件(MRE)和6个类金属应答元件(MLS,MRE-like sequence),推断WD基因的转录可能直接受铜或其它金属的调节。
4.存在的基因转录调控元件:
4.1.转录调控因子结合位点:Sp1、Ap1、Ap2、HNF1、HNF3、CTF、NF1、C/EBP;
4.2.应答元件4个金属应答元件(MRE)和6个类金属应答元件(MLS,MRE-like sequence);
4.3.顺式作用元件:CAATbox、Gcbox、E-box。
上述转录调控元件与国内外报道一致。
5.由于在启动子区5’上游未发现TATA框,故WD基因启动子属非典型启动子。
6.通过对WD基因启动子区的多态和突变研究,使我们对WD基因的分子发病机制有了更深一步的研究,进一步认识到WD基因的分子发病机制的多样性及复杂性,除已知的外显子、启动子外,可能存在其它的序列和结构如内含子、增强子等与WD基因的分子发病机制有关。