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胃癌是一种致命的肿瘤疾病,在全世界范围内的总体生存率都较低,严重威胁着人类的健康。目前,胃癌是世界第五大癌症类型,已被确定为全球癌症死亡相关的主要原因之一。胃癌的发生是由宿主遗传、环境因素（如吸烟、饮酒、高盐等）和微生物因素（如幽门螺杆菌）等复杂相互作用的结果。这些现状表明,深入研究胃癌发生发展的分子机制对于胃癌的临床改善和预后具有重要意义。蛋白泛素化修饰参与调节多种细胞功能,包括靶向蛋白的降解、蛋白的膜转运、DNA损伤修复、信号转导等。线性泛素链作为近年来新发现的一种泛素链接方式,主要由泛素连接酶复合体（linear ubiquitin chain assembly complex,LUBAC）催化合成和去泛素化酶OTULIN特异性水解,处于两者共同调节的动态过程中。LUBAC复合体是目前已知的唯一能够催化合成线性泛素链的泛素连接酶。它主要由HOIP（HOIL1-interacting protein）,SHARPIN（SHANK associated RH domain-interacting protein）和HOIL1L（haem-oxidized IRP2 ubiquitin ligase 1L）三个分子组成。HOIP是LUBAC复合体的酶催化核心,SHARPIN和HOIL1对于HOIP的激活具有关键作用。已有研究表明,线性泛素化修饰可发生在NEMO、TNFR1和RIPK1等底物中,通过调节NF-κB和Wnt/β-catenin等信号通路,对固有免疫、炎症反应和血管生成等具有重要的作用。但是在肿瘤的发生发展中,线性泛素化修饰对胃癌生物学行为的影响目前尚不清楚。因此,从线性泛素化相关的蛋白入手,研究线性泛素化修饰如何调节胃癌的生物学行为,有助于揭示胃癌发生发展的新机制,具有重要的理论意义及潜在临床价值。有鉴于此,本文主要分两部分,分别研究了线性泛素化相关蛋白OTULIN及SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响和机制。本文的研究内容和主要结果结论如下:第一部分去泛素化酶OTULIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中呈高表达1.去泛素化酶OTULIN在多个数据库的胃癌中表达增高;2.去泛素化酶OTULIN在胃癌组织中表达明显高于癌旁组织;二、去泛素化酶OTULIN对胃癌细胞增殖以及迁移和侵袭能力的影响1.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的增殖和成瘤;2.去泛素化酶OTULIN促进胃癌细胞的侵袭和迁移;3.OTULIN促胃癌细胞迁移侵袭依赖于其去泛素酶活性;三、识别与鉴定线性泛素化修饰的底物蛋白RACK11.Pull-down实验结合质谱分析,筛选出底物蛋白RACK1;2.免疫共沉淀实验证明RACK1蛋白存在线性泛素化修饰;四、OTULIN与RACK1相互作用,并与黏着斑激酶FAK形成复合体1.免疫荧光实验证实OTULIN和RACK1存在共定位;2.免疫共沉淀实验证明OTULIN、RACK1和FAK形成复合体;五、OTULIN调节RACK1对FAK的招募,影响胃癌细胞的粘附运动1.敲除OTULIN能够抑制FAK的磷酸化水平;2.OTLUIN能够促进RACK1对FAK的招募;3.OTULIN敲除的胃癌细胞粘附运动能力下降;第二部分SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响及机制研究一、SHARPIN通过不依赖于线性泛素化的方式调节Wnt/β-catenin信号通路1.LUBAC和OTULIN参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;2.SHARPIN与β-catenin相互作用参与Wnt/β-catenin信号通路的调节;二、SHARPIN促进胃癌的恶性生物学行为1.SHARPIN促进胃癌细胞的增殖、克隆形成和迁移侵袭;2.SHARPIN促进胃癌细胞皮下移植瘤的生长;三、SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin,而抑制β-catenin的泛素蛋白酶体降解1.SHARPIN抑制β-catenin的泛素化降解;2.SHARPIN与β-Trcp1竞争性结合β-catenin;3.SHARPIN与β-Trcp1可能竞争性结合β-catenin上的相同位点;四、过表达β-catenin回复SHARPIN敲低引起的胃癌细胞增殖抑制1.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的胃癌细胞增殖、克隆形成和迁移侵袭表型;2.过表达β-catenin回复SHARPIN敲低导致的皮下移植瘤的增殖抑制;五、SHARPIN在胃癌组织中高表达且提示预后不良,并与β-catenin表达呈正相关1.SHARPIN在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织;2.SHARPIN高表达的胃癌患者总生存期短,预后较差;3.胃癌组织中SHARPIN表达与β-catenin表达呈显著正相关;本研究的主要结论为:1.去线性泛素化酶OTULIN能够通过去除RACK1蛋白的线性泛素化修饰,增强RACK1与黏着斑激酶FAK的相互作用,进而促进胃癌的增殖和转移播散。2.线性泛素化相关蛋白SHARPIN通过与β-Trcp1竞争性结合β-catenin上的相同位点,从而抑制了β-Trcp1泛素化降解β-catenin,稳定其表达和向细胞核转位,促进下游癌基因c-myc、CD44等基因的表达,进而促进肿瘤的发生发展。本研究首次报道了线性泛素相关蛋白OTULIN和SHARPIN对胃癌恶性生物学行为的影响。我们发现了线性泛素化修饰的新底物蛋白RACK1,并初步阐明了去泛素化酶OTULIN通过调节RACK1影响胃癌细胞增殖和转移播散的分子机制,为研究线性泛素化修饰在肿瘤中的作用提供了新的理论基础。另外,我们也发现SHARPIN通过不依赖于线性泛素化修饰的方式调节Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而促进胃癌的发生发展,揭示了SHARPIN的一种新功能和调节β-catenin的新方式。这些研究为探索胃癌发生发展的分子机制提供了新的研究方向,并可能成为潜在的改善胃癌患者治疗和预后的策略。