SUMO(small ubiquitin-like modifier)蛋白是在结构上类似于泛素的一类小分子蛋白修饰物,分子大小110~115个氨基酸。SUMO化修饰是蛋白翻译后修饰过程中的重要调节机制之一,通过SUMO蛋白可逆的结合到特异靶蛋白底物上来调节真核生物细胞中的多个过程。SUMO化修饰的功能主要体现在调控靶蛋白的功能、亚细胞定位和蛋白间的互作。大量研究表明,SUMO化修饰在植物生长发育、激素信号转导、抗病防御以及对非生物胁迫的响应等方面具有重要作用,然而SUMO化修饰在豆科作物大豆中的研究开展较少。本研究首先利用已发表的模式植物拟南芥SUMO系统成员,通过同源比对的方法对大豆基因组中SUMO系统成员进行搜索,通过序列特征、保守结构域和SUMO化作用位点的分析,对大豆SUMO系统各家族成员进行进一步确定;同时利用已报道的人类、酵母、番茄、水稻、杨树和玉米等物种的SUMO系统成员,采用MEGA分析的方法进行系统进化发育树分析,推测大豆SUMO系统各家族成员的进化及亲源关系;通过对SUMO系统成员起始密码子的上游1500bp序列中的顺式作用元件进行搜索,推测其可能响应的胁迫、激素等信号诱导和组织定位;利用已发表的Soybase中的RNA-Seq数据对各成员的组织表达特异性进行分析;对大豆幼苗进行盐、高温和ABA胁迫处理,在处理不同时间点取材,利用qRT-PCR技术分析SUMO系统关键基因的表达模式;利用Western blot技术对胁迫处理前、后大豆SUMO结合物的动态变化进行检测;另外,本研究对大豆SUMO化底物进行了预测,通过功能分类探索底物蛋白可能参与的生物学过程;最后利用大肠杆菌表达系统建立了大豆SUMO化底物的体外验证系统,并进行了关键底物蛋白的体外SUMO化鉴定。本研究为从蛋白翻译后修饰的角度进一步研究大豆响应非生物胁迫的分子机制奠定了基础,同时为大豆SUMO化底物的筛选与鉴定提供了候选资源和验证体系。本研究取得的主要研究结果如下:1.通过同源比对在大豆基因组中确定了共40个SUMO系统相关基因,包括SUMO分子、激活酶E1、结合酶E2、连接酶E3、SUMO特异性蛋白酶和SUMO链结合蛋白共6个家族;通过保守功能域分析、氨基酸大小和等电点分析等表明各家族间成员相对保守;亚细胞定位预测显示大部分成员在细胞核内表达,符合SUMO化修饰的功能定位。2.启动子分析表明,大豆SUMO系统成员的启动子中具有响应非生物胁迫和植物激素信号的顺式元件,并包括一些植株生长发育相关元件,推测大豆SUMO系统相关基因具有受非生物胁迫、激素等诱导表达及组织部位表达特异性。首先对大豆不同发育时期的RNA-Seq数据进行分析,结果显示SUMO系统成员呈现不同的组织表达特异性,且大部分成员在根中表达量较高,因此后续表达分析选择胁迫处理后的大豆幼苗根部作为实验材料。3.通过qRT-PCR对150 mM NaCl、42℃高温和100μm ABA胁迫处理不同时间点的大豆根系中13个大豆SUMO系统基因进行表达模式分析,表明大豆SUMO系统成员在非生物胁迫处理下具有转录水平的响应,且大部分上调表达;利用拟南芥抗AtSUMO1抗体对大豆3种胁迫处理不同时间点的SUMO结合物水平进行Western blot分析,表明大豆幼苗在高盐、高温和ABA处理早期即表现出SUMO结合物显著增多的趋势,且随着处理时间的延长SUMO结合物逐渐减少至处理前的水平。4.通过in silico预测,得到679个非冗余大豆SUMO候选底物,功能分类表明底物蛋白参与了转录相关、胁迫防御和信号途径转导等多个生物学过程;利用大肠杆菌系统表达了大豆SUMO化修饰级联系统的关键成员及候选底物蛋白,对体外诱导表达的条件进行了优化,制备了同时表达GmSUMO、GmSAE1/2和GmSCE蛋白的原核表达大肠菌株,建立了大豆SUMO化体外验证系统;并对SUMO化候选底物GmMLP423进行了三质粒共转化,抗AtSUMO1抗体和抗Trx标签抗体WB检测初步证明其可在体外发生SUMO化。