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甘薯起源于拉丁美洲,在许多亚洲国家,特别在中国和日本是一种重要经济作物。甘薯块根中除了贮存有大量的淀粉和蛋白质外,还含有丰富的小分子糖类、氨基酸、维生素、黄酮类等营养物质,具有较高的营养价值。其中花青苷含量高的紫肉甘薯品种又格外受到人们的欢迎,花青苷对人类的健康方面起着重要的作用,能够保护神经系统、预防心血管疾病与糖尿病、抗癌症,同时可以通过减少脂肪生成,氧化应激以及改善炎症来调控人类肥胖相关的代谢控制。高等植物中花青苷的代谢途径是相对保守的,除了结构基因之外,由MYB、bHLH和WD40转录因子组成的MBW转录调控复合体已被广泛报道参与花青苷的代谢途径。由于甘薯是同源六倍体植物,其遗传基础复杂,这造成甘薯分子机制研究的滞后。已有的研究表明,IbMYB1在甘薯块根中特异性表达调控花青苷的生物合成,IbWD40、IbDFR、IbUF3GT等亦在甘薯花青苷的生物合成中起着关键作用。但MYB340-bHLH2-NAC56a/b调控复合体是如何参与甘薯花青苷合成代谢及其相应的分子调控机制是什么,尚不清晰且未见报道。我们通过系统进化树、氨基酸序列比对等生物信息学分析结果筛选得到了候选甘薯花青苷调控MYB转录因子IbMYB340、IbMYB44、IbMYB44.2、IbMYB44.3、IbMYB44.4;NAC 转录因子 IbNAC56a、IbNAC56b.;bHLH转录因子IbWbHLH2。本文以甘薯块根中花青苷含量不同的紫肉甘薯、黄肉甘薯和白肉甘薯为研究材料,其中紫肉甘薯品种选取韩紫、徐紫8、浙紫3与浙学4,黄肉甘薯品种选取苏薯8号与广薯87,白肉甘薯品种选取栗子香与徐薯18。采用RT-qPCR分析了上述转录因子以及花青苷合成代谢相关结构基因IbDFR、IbANS、IbUFGT在不同品种甘薯块根中的表达丰度,我们发现不同品种甘薯块根的花青苷含量同IbMYB340、IbNAC56a、IbNA C56b、IbbHLH2、IbANS的表达丰度呈显著正相关,而与IbMYB44、IbMYB44.2、IbMYB44.3、IbMYB44.4的表达丰度则呈显著负相关;同时通过相关性分析,我们发现IbANS与IbNAC56a、IbNAC56b、IbMYB340、IbbHLH2基因表达量水平以及不同品种甘薯块根的花青苷含量之间呈正相关,相关系数分布在0.45～0.81,这表明IbMYB340、IbMYB44s、IbbHLH2、IbNAC56a、IbNAC56b 可能会参与到甘薯花青苷的合成代谢中,而IbANS可能是关键的靶基因。为了验证上述转录因子是否参与调控甘薯花青苷的合成代谢,我们在烟草叶片或草莓果实中进行异源表达,从而探究候选转录因子的基因功能。我们发现IbMYB340单独转化能够诱导烟草与草莓中花青苷的积累,并能够明显激活烟草花青苷代谢途径关键基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtDFR、NtANS与NtUFGT以及草莓FvF3H、FvANS、FvDFR、FvUFGT的表达水平,说明IbMYB340作为激活子参与调控甘薯花青苷生物合成。在烟草与草莓中共转化IbMYB340、IbbHLH2、IbNAC56a或IbNAC56b时,我们可以观察到强烈的色素沉积。同时我们发现三者共转化烟草时,相较于空载(pSAK277),烟草中 NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtDFR、NtANS 与 NtUFGT 的基因表达量都显著上调,其中NtANS基因表达量上调了 1000倍以上;而在共转化草莓时,FvF3H、FvANS与FvDFR的表达水平显著升高,其中FvANS为空载的200倍左右。这表明IbMYB340、IbbHLH2和IbNAC56a或IbNAC56b可能通过形成调控复合体的方式,进一步参与花青苷的代谢过程,而IbANS可能作为转录因子的关键靶基因参与调控甘薯花青苷代谢途径。在IbMYB44s同IbMYB340共转化烟草叶片时,我们发现4个MYB转录因子对IbMYB340基因功能有着不同程度的抑制作用,RT-qPCR分析亦表明共转化时不同程度下调了 NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtDFR、NtANS 与 NtUFGT 的基因表达量,说明IbMYB44s可能会在甘薯花青苷生物合成过程中扮演抑制子的角色。双荧光酶实验结果显示IbMYB340单独转化可以激活IbANS的转录水平,在IbMYB44s、IbbHLH2或IbNA C56a单独转化时,则没有检测到激活效应,而IbMYB340、IbbHLH2和IbNAC56a或IbNAC56b三者共转化显著激活了IbANS的转录水平。此外,IbMYB44s与IbMYB340共转化时,削弱了IbMYB340对IbANS启动子的转录激活活性,这表明IbMYB44s充当甘薯花青苷合成代谢的抑制子。YIH结果显示只有IbMYB340能够结合到IbANS启动子上,这表明IbMYB340作为关键调节因子参与到甘薯花青苷生物合成的代谢调控。Y2H与荧光素酶互补分析表明IbMYB340与IbMYB44s、IbbHLH2、IbNA C56a或IbNAC56b存在互作效应;IbMYB44与IbNAC56a或IbNAC56b存在互作效应;IbbHLH2与IbNAC56a或IbNAC56b则没有相互作用。上述结果表明,IbMYB340与IbbHLH2、IbNAC56a或IbNA C56b相互作用,通过形成调控复合体来调控甘薯花青苷的生物合成,而IbMYB44s可能会以形成MYB44-MYB340 或 MYB44-NAC56a/b 复合体方式抑制 MYB340-bHLH2-NAC56a/b调控复合体的形成,从而负调控甘薯花青苷的生物合成。最后我们提出了一个包含转录因子IbMYB340、IbMYB44s、IbbHLH2和IbNAC56a/b与关键靶基因IbANS的甘薯花青苷生物合成潜在的分子调控模型图,有助于加强我们对不同颜色甘薯块根形成调控网络机制的认识与了解。