研究背景卵巢功能减退是指卵巢内分泌功能和生育能力下降,并与女性生理年龄不符,常见的原因有遗传、肿瘤、自身免疫、医源性等因素。放射治疗是治疗恶性肿瘤最常用的方法之一,对于女性患者最大的弊端是导致卵巢功能减退甚至衰竭。放射治疗是由一种或多种电离辐射的治疗方式组成的医学治疗。通俗的讲,放射治疗就是利用放射源或各种医疗设备产生的高能射线对肿瘤进行治疗的技术,简称“放疗”(radiotherapy, RAD)。放疗设备产生的射线对任何生物都会产生物理学效应、化学效应、生物反应等一系列辐射生物效应。射线的这种特性叫电离辐射。射线正是利用该特性治疗肿瘤。医用电子直线加速器：是利用微波电场,沿直线加速电子到较高的能量应用于医学临床的装置。其中放疗设备产生的电离射线可以与组织中的水分子发生作用形成高活性的自由基团,这些自由基团可诱导细胞发生凋亡,凋亡的途径主要有外在途径(extrinsic pathway),由细胞表面的死亡受体如肿瘤坏死因子受体家族(tumor necrosis factor receptor, TNF-R)引发;另一种称为内在途径(intrinsic pathway)或线粒体途径(mitochondrial pathway),由许多应激条件、化学治疗试剂和药物所引发。线粒体为一双层膜围成的囊状结构,外膜与内膜间的空腔称为外室,由内膜包围的腔称为内室或线粒体基质,线粒体外膜通透性较大,而内膜通透性比较小。然而质子泵存在于内膜,它将基质内质子泵输入外室,从而形成横跨线粒体内膜的线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential, MTP).线粒体跨膜电位的改变与许多的机制有关。通过实验证明凋亡发生时,线粒体膜电位降低,线粒体膜通道孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)开放,进而线粒体内的细胞色素C (cytochrome c, cytc)释放进入胞质,引起半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)级联反应。此外, C aspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶,能够特异的切割靶蛋白。Caspase主要负责的是选择性地切割某些蛋白质,切割的结果是使靶蛋白活化或失活,并非完全降解。目前很多研究证明了Caspase1和3与线粒体跨膜电位之间存在关联,研究表明：所有动物细胞都具有类似的凋亡机制,蛋白酶Caspase在其中发挥很重要的作用,这种凋亡方式被称为Caspase依赖性的细胞凋亡。褪黑素(N-acetyl-5-methoxytryptamine, MT)作为一种由哺乳动物和人类的松果体产生的胺类激素为人们所熟知。大量研究表明,褪黑素可以调节光周期动物的生殖活动。早期的研究报道了下丘脑和垂体前叶可以调节褪黑素的合成。这在一定程度上也证明了褪黑素的受体存在于大脑的视交叉上核和垂体结节部。同时研究还发现在卵巢中有褪黑素受体的存在,这表明了褪黑素对生殖系统的重要影响。近年来学者们对褪黑素清除自由基的作用进行了广泛的研究。发现其对抗由放疗/化疗及自身免疫性疾病引起的卵巢功能损伤有着显著作用。但对其保护卵巢功能的具体的机制尚不明确。本实验以瑞典Elekta Precise医用直线加速器全身照射大鼠制作放疗致大鼠卵巢功能减退的模型,观察放疗后各组大鼠卵巢组织形态学改变,各级卵泡数量及激素水平的变化情况,分析不同剂量褪黑素对卵巢功能的保护作用,进而通过观察放疗组氧化应激指标(羟基)与线粒体凋亡途径指标(线粒体膜电位、细胞色素C、caspase3活性),来研究放疗是否通过氧化应激诱导了卵巢组织的损伤,且损伤是否经由线粒体通路发生。同时观察褪黑素组中相应指标的变化,来阐明褪黑素保护卵巢功能的机制,为放疗所致卵巢功能损伤的治疗提供参考,最终将研究成果进行转换,用于提高临床诊疗水平。目的通过分析放疗后大鼠卵巢组织中氧化应激指标(羟基)、线粒体膜电位、细胞色素C和caspase3活性的变化,探讨放疗所致卵巢功能损伤是否通过氧化应激所诱导,且该损伤是否经由线粒体通路发生；同时给予不同剂量的外源性褪黑素治疗卵巢功能损伤,观察不同剂量组的卵巢功能损伤程度,来阐明褪黑素对卵巢功能的保护作用,为今后治疗放疗所导致卵巢功能减退以及相继发生的女性生殖及和性功能减退的问题,提供依据和实验室研究基础。方法1实验动物的筛选清洁级SD雌性大鼠(体重180-200g),购置南京军区南京总医院比较医学科。颗粒饲料喂养,自由摄食,室温20-25℃,相对湿度45%一55%,每日光照12h,饲养3天熟悉环境后,每日晨8：00取阴道分泌物涂片光镜观察性周期,选用有正常性周期的动物进入实验。2实验分组与放疗模型的制作将进入实验的24只大鼠随机分成4组：对照组(6只)、Rad组(6只).Rad+MT (50mg/kg)组(6只)、Rad+MT (100mg/kg)组(6只)。对照组：给予5m1酒精生理盐水(0.9%生理盐水和100%乙醇按9：1体积比配制)腹膜下注射；Rad组给予5m1酒精生理盐水腹膜下注射,2h后接受总量为200cGy射线照射,照射速度50cGy/min,照射野30*30cm,照射距离150cm; Rad+MT (50mg/kg)组、Rad+MT (100mg/kg)组：分别给予相应剂量的褪黑素溶解于5ml酒精生理盐水腹膜下注射,2h后接受总量为200cGy射线照射(照射条件同射线照射组)。以上动物于射线照射后每日阴道分泌物涂片观察动情周期,照射后2周于动情间期处死大鼠,取双侧卵巢,右侧卵巢4%多聚甲醛固定,左侧卵巢存于液氮罐。大鼠腹主动脉采血,分离血清。3激素的测定采用ELISA法测定大鼠血清中的雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)。按试剂盒操作说明进行。4卵巢组织形态学观察及卵泡计数右侧卵巢石蜡包埋,取最大横断面切片后HE染色,光镜下计数具有正常卵泡结构的卵泡数,分别计数各组大鼠的原始卵泡、生长卵泡(包括初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡)、成熟卵泡。5羟自由基的测定利用Fenton反应测定左侧卵巢组织中的羟自由基的浓度,Fenton反应是常见的产生羟自由基的化学反应,过氧化氢的量与Fenton反应产生的羟基的量成正比,当给予电子受体后,用griess试剂显色,形成红色物质,其呈色与羟基的多少成正比。按试剂盒操作说明进行。6线粒体膜电位的测定左侧卵巢组织使用组织线粒体提取试剂盒分离胞浆和线粒体,JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位,在线粒体膜电位较高时,JC-1聚集在线粒体的基质(matrix)中,形成聚合物(J-aggregates),可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时,JC-1不能聚集在线粒体的基质中,此时JC-1为单体(monomer),可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例,按试剂盒操作说明进行。7细胞色素C的测定左侧卵巢组织使用组织线粒体提取试剂盒分离胞浆和线粒体,使用ELISA法测定大鼠卵巢组织中细胞色素C的浓度8caspase3活性的测定采用分光光度法测定大鼠卵巢组织caspase3活性。由于caspase3可催化底物Ac-DEVD-pNA产生黄色物质pNA,因此通过测定pNA在405nm的吸光度来测定caspase3活性。按试剂盒操作说明进行。9统计学方法所有指标采用SPSS18进行统计学分析,计量数据检测结果以均数±标准差(x±s)表示,多组间差异的比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA),两两组间比较采用最小显著差异法(LSD)检验,若方差不齐,两两比较采用基于t检验的保守Tambane’s T2检验,以P≤0.05为差异有统计学意义。结果1大鼠动情周期变化各组大鼠干预前均为正常动情周期,4天为1周期。Rad组接受照射后仅出现动情后期或动情间期。Rad+MT (50mg/kg)组、Rad+MT (100mg/kg)组大鼠照射后仅出现动情后期或动情间期,一周后恢复正常动情周期。对照组动情周期无改变。2大鼠血雌激素(E2)和卵泡刺激素(FSH)水平变化正常对照组、Rad+MT (100mg/kg)组、Rad+MT (50mg/kg)组、Rad组中血E2水平依次降低,FSH水平依次升高,其中Rad+MT (50mg/kg)组与Rad+MT (100mg/kg)组比较,FSH水平差异无统计学意义(P>0.05),其余各组比较,E2和FSH水平差异均有统计学意义(P<0.05)。3大鼠卵泡数量变化及光镜下卵巢组织形态学改变正常对照组、Rad+MT (100mg/kg)组、Rad+MT (50mg/kg)组、Rad组的卵泡总数依次减少,各组间比较,卵泡总数差异有统计学意义(P<0.05)。光镜下：对照组卵巢,清晰可见各级正常发育的窦卵泡及发育成熟的卵泡；Rad组卵巢,各级卵泡数量明显减少,见大量闭锁卵泡及大量陈旧样黄体；Rad+MT (100mg/kg)组卵巢,可见各级正常发育的窦卵泡及发育成熟的卵泡,并见少量黄体。4大鼠卵巢组织羟基浓度、capase3活性、细胞色素C浓度及线粒体膜电位的变化在正常对照组、Rad+MT (100mg/kg)组、Rad+MT (50mg/kg)组、Rad组的卵巢组织中,羟基浓度、capase3活性、细胞色素C浓度依次升高,而线粒体膜电位则依次降低。各组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究证明了放疗可致卵巢组织发生不可逆的损伤并伴随激素水平的变化。分析放疗后大鼠卵巢组织中氧化应激指标(羟基)与线粒体凋亡途径指标(线粒体膜电位、细胞色素C、caspase3活性),发现羟基的浓度、细胞色素C的浓度及caspase3的活性与卵巢组织损伤存在正相关,而线粒体膜电位与卵巢组织损伤的存在负相关,可以推测放疗促使机体产生了氧化应激,而氧化应激诱导了卵巢组织的损伤,且该损伤正是经由线粒体凋亡通路发生；并通过分析不同剂量褪黑素治疗组卵巢组织损伤程度的变化,发现褪黑素对放疗所致卵巢功能损伤具有保护作用,且呈剂量依赖性,此外,褪黑素剂量依赖性地降低了卵巢组织中氧化应激指标羟基的浓度,并且抑制了线粒体膜电位的降低、细胞色素C的释放以及caspase3的激活,因此我们得出结论：褪黑素的抗氧化和抗凋亡特性可以减轻放疗所致的卵巢功能损伤。