低温作为一种主要的逆境胁迫,不仅影响植物的生长发育,还限制植物的地理分布。为了应对低温胁迫,植物进化出了复杂而精细的调控网络,其中研究的最为广泛的是以转录因子CBF/DREB1(C-repeat binding factor/dehydration-responsive element binding factor 1)为核心的低温信号通路。当植物感知低温信号后,能迅速诱导CBFs基因表达,进而激活其下游的COR基因表达,增强植物对低温的耐受能力。拟南芥中CBFs转录因子包含3个成员,分别为CBF1/DREB1B、CBF2/DREB1C和CBF3/DREB1A,它们紧密的串联排列于拟南芥第4号染色体上。在植物中过表达CBFs基因使植物的抗冻性明显增强。然而,由于CBFs基因在染色体上串联排列的特点,传统的遗传杂交很难获得cbfs纯合缺失二突变体,这极大限制了人们对CBFs功能的深入研究。此外,目前对于CBFs的研究大多数集中在其转录调控上,人们陆续发现1CE1、CAMTA3、MYB15、EIN3等一系列转录因子调控CBFs的基因表达,并且还发现E3连接酶HOS1、COP1和SIZ1,以及蛋白激酶SnRK2.6/OST1和MPK3/6等对CBF上游关键转录因子ICE1蛋白进行翻泽后修饰,进而调节CBFs的基因表达。但是对于CBFs的翻译后调控人们知之甚少。仅有报道表明,位于细胞膜上的CRPK1蛋白激酶被低温激活并将下游的14-3-3蛋白磷酸化。磷酸化形式的14-3-3蛋白进入细胞核与CBF1/3蛋白互作,促进CBF1/3通过26S蛋白酶体途径降解。此外,最新的研究发现蛋白激酶SnRK2.6能够将BTF3s蛋白磷酸化,促进BTF3s与CBFs蛋白互作并增强CBFs蛋白的稳定性。但是,CBFs蛋白在低温条件下的表达模式以及是否还受到其它翻译后修饰的调控目前尚不清楚,有待进一步研究。为了确证CBFs基因在植物响应低温信号过程中的贡献程度,本研究通过CRISPR/Cas9技术构建了cbf1 cbf2、cbf1 cbf3和cbf2 cbf3双突变体以及cbfs三突变体。表型分析表明,在正常温度下,cbfs突变体地上部分的生长发育与野生型没有明显差异,主根长度明显短于野生型。然而在冷胁迫条件下,cbfs突变体地上部分的生长明显比野生型大,与野生型根长的差异也明显缩短。表明cbfs突变体对低温的响应明显减弱。此外,冻处理实验结果表明,非冷锻炼条件下,cbfs突变体与野生型没有明显差异,而冷锻炼后cbfs表现出显著的冻敏感表型。此外,cbf1,2、cbf1,3和cbf2,3双突变体在冷锻炼后也表现出不同程度的冻敏感表型。表明CBFs在植物冷锻炼过程中起着非常重要的作用。进一步的RNA sequencing分析表明,CBFs共调控134个基因的表达,其中正调控112个基因的表达,负调控22个基因的表达。这部分研究不仅证明CBFs是植物低温信号途径中重要的调控因子,也为进一步研究依赖于CBF的信号通路提供了理想的遗传材料。为了探究CBFs蛋白是否受低温调控,本研究检测了冷胁迫条件下拟南芥内源CBFs蛋白的表达。结果显示,在正常温度下CBFs蛋白基本不表达,而随着低温处理,CBFs蛋白逐渐积累。当处理时间继续延长则蛋白逐步降解。表明CBFs蛋白受低温诱导表达。为了观察CBFs蛋白表达的组织定位,本研究构建了 CBFs自身启动子驱动的CBFs基因与GUS基因的融合载体,并将其转入拟南芥中。GUS染色结果表明,CBFs蛋白主要在拟南芥的根、下胚轴和叶脉中表达。将GUS替换成GFP后,本研究对根中表达的CBFs进行了进一步观察。结果表明,在根成熟区的中柱里可以观察到CBF1、CBF2和CBF3蛋白表达。在伸长区和分生区的细胞中则只能观察到CBF2和CBF3蛋白表达。此外,本研究还发现CBF3在气孔中也有积累。这些结果说明,CBFs主要在植物的维管组织中表达。为了研究CBFs蛋白的翻译后调控,本研究通过荧光素酶互补实验(LCI)和双分子荧光互补实验(BiFC)证明SnRK2蛋白激酶家族的3个成员,SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6与CBFs存在相互作用。体外pull-down实验进一步表明,SnRK2.2/2.3/2.6直接与CBFs发生互作。体外磷酸化实验表明SnRK2.2/2.3/2.6直接将CBFs磷酸化。本研究还发现,SnRK2.6磷酸化CBFs增强CBFs的蛋白稳定性。蛋白免疫印迹实验表明,与野生型Co1相比,CBFs蛋白的稳定性在ost1-4突变体中明显降低。同时,模拟非磷酸化形式的CBF2(CBF2S196A)蛋白无论在体外还是体内降解实验中,稳定性都明显低于CBF2WT。此外,烟草瞬时表达系统、EMSA实验和ChIP实验表明,SnRK2.6增强了 CBFs的转录活性,而CBF2S196A转录活性明显降低。以上结果说明,SnRK2.6能够增强CBFs蛋白的稳定性和转录活性。由于前人的研究已经证明SnRK2.6正调控植物的抗冻性,因此本研究检测了snrk2.2 snrk2.3双突变体的抗冻性。实验结果表明,snrk2.2 snrk2.3双突变体无论在非冷锻炼还是冷锻炼后都表现出冻敏感表型。此外,qRT-PCR检测表明,在冷胁迫条件下,snrk2.2 snrk2.3双突变体中CBF下游COR基因的表达水平明显降低。表明SnRK2.2、SnRK2.3与SnRK2.6类似,同样正调控植物对低温的响应。由于SnRK2蛋白在ABA信号通路中起着关键作用,因此本研究进一步检测了CBFs是否参与ABA信号通路。结果表明,ABA能够一定程度诱导CBFs基因表达,且在cbfs突变体中,位于CBF下游的ABA响应基因表达水平明显降低。表型分析发现,cbfs突变体表现出对ABA不敏感而对干旱超敏感的表型。这些结果说明CBFs正调控拟南芥对ABA的响应过程。综上所述,CBFs基因在拟南芥冷锻炼过程起着关键的作用。蛋白激酶SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6作为重要的正调控因子,通过磷酸化CBFs,增强CBFs的蛋白稳定性和转录活性,从而正调控拟南芥的抗冻性。同时,CBFs基因也在ABA信号响应中发挥着重要作用。这些结果不仅确证CBFs在植物响应低温信号通路中的作用,同时阐明了 CBFs翻译后修饰调控,丰富了植物响应低温信号的调控网络。