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第一章Ox-LDL对人脐静脉血内皮祖细胞增殖、凋亡的影响以及抗氧化剂美乐托宁的作用近年研究证实人脐带血、成人外周血及骨髓中均存在内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs),EPCs是血管内皮细胞的前体细胞,是以CD133,VEGFR-2(KDR),CD34为标志的一群细胞,可以迁移、增殖并分化为成熟的内皮细胞,促进内皮的修复及出生后新生血管化的形成。EPCs的数量受多种内源性和外源性因素的影响。最近,有研究表明氧化低密度脂蛋白(oxidized low-densitylipoprotein,ox-LDL)可以阻止VEGF诱导的EPCs分化,促进其老化,导致细胞功能失调。Ox-LDL是低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein,LDL)氧化修饰后的产物,因此,抗氧化治疗对EPCs的分化以至内皮的修复及新生血管化的形成可能是一条新途径。美乐托宁(melatonin,MT)又名褪黑素,是松果体分泌的激素,许多研究表明MT是体内强自由基清除剂和抗氧化剂,能通过清除自由基保护机体免受氧化损伤,从而抑制细胞死亡或凋亡的发生。本研究拟观察ox-LDL对人脐静脉血EPCs增殖、凋亡及功能的影响以及抗氧化剂MT的保护作用。目的:观察Ox-LDL对人脐静脉血EPCs增殖、凋亡及功能的影响以及抗氧化剂美乐托宁(melatonin,MT)的作用。方法:密度梯度离心法获取人脐静脉血单个核细胞,培养7天后收集贴壁细胞,分成7组:(1)空白对照组:先用不含胎牛血清的RPMI1640培养液培养24 h,然后换含胎牛血清的RPMI1640培养液;(2)ox-LDL各浓度组(共3组):不含胎牛血清的RPMI1640培养液培养24 h后,再分别用含5,10,20mg/L ox-LDL的条件培养液培养(6、12、24和48)h;(3)MT+ox-LDL各浓度组(共3组):不含胎牛血清的RPMI1640培养液培养24 h后,再分别用含0.5,1.0,2.0mmol/L MT的条件培养液培养(6、12、24和48)h,然后换用含10mg/L ox-LDL的RPMI1640培养液培养24h。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪鉴定EPCs,分别观察EPCs的数量、迁移、粘附能力,观察EPCs凋亡形态,采用MTT法检测EPCs增殖能力,并用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:1.Ox-LDL呈浓度依赖关系减少EPCs增殖、诱导EPCs凋亡,20mg/L ox-LDL对EPCs增殖、凋亡的影响最为显著(P＜0.01)。另外,各浓度ox-LDL呈时间依赖关系减少EPCs增殖,于48h达到高峰(P＜0.01)。Ox-LDL也显著损害了人脐静脉血EPCs的数量、黏附和迁移能力,作用呈浓度和时间依赖性。2.在加ox-LDL(10 mg/L)前加MT干预,EPCs增殖能力较ox-LDL组明显增强,细胞凋亡率明显降低(P＜0.01);EPCs的数量、黏附和迁移能力较ox-LDL组明显改善,作用呈浓度和时间依赖性。结论:Ox-LDL可诱导EPCs凋亡并损害EPCs功能,而抗氧化剂美乐托宁可拮抗ox-LDL的作用。第二章Ox-LDL诱导人脐静脉血内皮祖细胞凋亡的信号转导途径研究Ox-LDL是低密度脂蛋白(low—density lipoprotein,LDL)氧化修饰后的产物。Ox-LDL具有很强的细胞毒性,可选择性作用于细胞循环周期的S期,对增殖活跃期细胞的细胞毒作用更强。研究表明ox-LDL可以阻止VEGF诱导的EPCs分化,促进其老化,导致细胞功能失调。但是,究竟是通过何种机制导致EPCs数量及功能的变化还是未知。本课题的前期工作证实,Ox-LDL显著减少人脐静脉血EPCs数量、诱导EPCs凋亡,也损害了EPCs的增殖、黏附和迁移能力。本研究通过体外培养的人脐静脉血EPCs,拟进一步探讨氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉血内皮祖细胞凋亡的信号途径。目的:探讨氧化低密度脂蛋白诱导人脐静脉血内皮祖细胞凋亡的信号途径。方法:密度梯度离心法获取人脐静脉血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞分成以下各组:(1)空白对照组:不作任何处理,以RPMI1640培养液继续培养48h;(2)ox-LDL各浓度组(共3组):EPCs培养24h后,再分别换用含5,10,20mg/Lox-LDL的RPMI1640培养液继续培养24 h;(3)MT+ox-LDL各浓度组(共3组):先分别用含0.5,1.0,2.0mmol/L MT的RPMI1640培养液培养24 h,然后移去含MT的RPMI1640培养液,加入含10mg/Lox-LDL的RPMI1640培养液继续培养24h。Western blot检测细胞内Akt、磷酸化Akt的蛋白表达时加上以下两组:(4)Wortmannin组:EPCs培养24h后,换用含Wortmannin 100μmol/L RPMI1640培养液继续培养24h;(5)MT+Wor+ox-LDL组:先用含1.0mmol/L MT的RPMI1640培养液培养24h,然后移去含MT的RPMI1640培养液,换用含Wortmannin 100μmol/L、ox-LDL10mg/L的RPMI1640培养液继续培养24h。采用MTT法检测EPCs增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡率;提取细胞RNA,采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术检测Bcl-2mRNA表达;采用免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白表达水平;采用Western blot检测磷酸化Akt的蛋白表达。结果:1.Ox-LDL显著减少EPCs增殖、诱导EPCs凋亡,同时使Bcl-2mRNA和蛋白的表达下降,并降低磷酸化Akt的表达;2.PI3K特异性抑制剂Wortmannin处理EPCs后,磷酸化Akt的表达不明显;3.MT预处理EPCs能够抑制ox-LDL所导致的凋亡率增加、增殖减少,能够上调Bcl-2mRNA和蛋白的表达,增加磷酸化Akt的表达。结论:Ox-LDL抑制EPCs增殖、诱导EPCs凋亡的作用是通过抑制Akt活化,下调凋亡抑制蛋白Bcl-2实现的;MT能上调磷酸化Akt蛋白及凋亡抑制蛋白Bcl-2水平,抑制ox-LDL的作用;Ox-LDL的作用机制至少部分是依赖PI3K/Akt信号通路实现的。第三章美乐托宁对冠心病患者循环血中EPCs增殖与凋亡影响的体外研究美乐托宁(melatonin,MT)又名褪黑素,是松果体分泌的激素,许多研究表明MT是体内强自由基清除剂和抗氧化剂,能通过清除自由基保护机体免受氧化损伤,从而抑制细胞死亡或凋亡的发生。越来越多的研究显示,MT及其抗氧化作用与心血管疾病关系密切;而EPCs在内皮损伤后的修复中、在缺血组织的血管新生过程中起重要作用,与心血管疾病密切相关,但MT对EPCs分化的影响及其可能的机制迄今尚未见公开报道。本课题的前期工作表明:MT预处理人脐静脉血EPCs能够抑制ox-LDL所导致的凋亡率增加、增殖减少,能够上调Bcl-2mRNA和蛋白的表达,增加磷酸化Akt的表达。在此基础上,本研究通过体外培养的冠心病患者循环血EPCs,拟观察MT对冠心病患者循环血中EPCs增殖、凋亡与功能的影响,以探讨MT对冠心病患者EPCs的保护作用及其可能的细胞机制。目的:探讨抗氧化剂美乐托宁对冠心病患者循环血中EPCs增殖与凋亡的影响及其机制。方法:选择性冠状动脉造影确定冠心病患者36例,密度梯度离心法获取冠心病患者外周血单个核细胞,培养7天后,收集贴壁细胞分成4组:(1)空白对照组:先用不含胎牛血清的RPMI1640培养液培养24h,然后换含胎牛血清的RPMI1640培养液;(2)MT各浓度组(共3组):不含胎牛血清的RPMI1640培养液培养24 h后,分别换用含0.5,1.0,2.0mmol/L MT的条件培养液培养(6、12、24和48)h。激光共聚焦显微镜和流式细胞仪鉴定EPCs,分别观察EPCs的迁移、粘附能力,采用MTT法检测EPCs增殖能力,并用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用RT-PCR技术检测Bcl-2mRNA表达,采用western blot检测Bcl-2的蛋白表达。结果:1.MT显著改善体外培养的冠心病患者外周血EPCs的粘附、迁移和增殖能力,作用呈浓度和时间依赖性;2.MT抑制体外培养的冠心病患者外周血中EPCs的凋亡,作用呈浓度和时间依赖性;3.MT上调EPCs内Bcl-2mRNA和蛋白的表达。结论:MT能改善体外培养的冠心病患者外周血EPCs的粘附、迁移和增殖能力,并通过上调凋亡抑制基因Bcl-2而发挥抑制EPCs凋亡的作用。