【摘 要】
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目的:探讨急性髓系白血病细胞中miR-34a对HDAC1的调控作用以及对细胞凋亡的影响。方法:1.将miR-34a mimics、miR-34a inhibitor、miR-34a scramble转染到HL-60细胞中,通过调控急性髓系白血病细胞中miR-34a表达,观察人急性髓细胞白血病细胞细胞增殖和凋亡,明确miR-34a对急性髓细胞白血病细胞细胞增殖和凋亡的影响。2.观察在miR-34a对
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目的:探讨急性髓系白血病细胞中miR-34a对HDAC1的调控作用以及对细胞凋亡的影响。方法:1.将miR-34a mimics、miR-34a inhibitor、miR-34a scramble转染到HL-60细胞中,通过调控急性髓系白血病细胞中miR-34a表达,观察人急性髓细胞白血病细胞细胞增殖和凋亡,明确miR-34a对急性髓细胞白血病细胞细胞增殖和凋亡的影响。2.观察在miR-34a对急性髓细胞白血病细胞细胞增殖和凋亡的影响过程中,HDAC1是否miR-34a的靶基因。Western blot检测miR-34a表达改变后HDAC1蛋白表达情况。3.构建含HDAC1 3’UTR的双荧光素酶报告载体,利用双荧光素酶报告实验验证miR-34a与HDAC1的作用位点。构建不含HDAC13’UTR的表达载体,回复实验验证miR-34a与HDAC1的相互作用。结果:1、miR-34a对HL-60细胞增殖和凋亡的影响(1)HL-60细胞中miR-34a表达qRT-PCR检测显示,miR-34a mimics转染HL-60细胞后,miR-34a表达水平与miR-NC组和Blank组比较显著升高(P<0.05),而将miR-34a inhibitor转染细胞后,miR-34a表达水平较miR-NC组和Blank组比较显著降低(P<0.05)。Blank组与miR-NC组比较无统计学差异(P>0.05)。(2)调控miR-34a对HL-60细胞增殖和凋亡的影响转染细胞48h后,CCK8实验显示,与miR-NC组和Blank组相比,miR-34a组细胞增值率显著降低(P<0.05),72和96h后差异更为显著。inhibitor组转染细胞48h后,细胞的增殖活力较对照组显著升高(P<0.05),72和96 h后差异更加显著。Blank组和miR-NC组在各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05)。Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞检测发现miR-34a mimics转染细胞后,细胞凋亡率较Blank组和miR-NC组显著升高(P<0.05);而miR-34a inhibitor转染HL-60细胞后,细胞凋亡率较较Blank组和miR-NC组显著降低(P<0.05)。2、miR-34a促进HL-60细胞凋亡的作用与其对HDAC1表达调控关系将miR-34a mimics转染HL-60细胞后,HDAC1蛋白表达与对照组相比显著降低,而降miR-34aa inhibitor转染HL-60细胞后,HDAC1蛋白表达较对照组显著升高这显示HDAC1可能是miR-34a的作用靶点。(2)将HDAC1野生型与突变型3′UTR区与双荧光报道载体pmirGLO连接,将重组载体与miR-34a mimics或miR-34a Scramble两两组合共转染到HL-60细胞中,比较各组荧光信号的强弱。结果显示,HDAC1-mut和miR-34a mimics共转染细胞后,细胞的荧光信号值与对照组(miR-NC和HDAC1-mut共转染组)相比无明显变化(P>0.05),而将miR-34a mimics和HDAC1-wt共转染细胞后荧光信号值与对照组比较显著降低(P<0.05)。提示,miR-34a能够与HDAC1的3′UTR区结合,抑制HL-60细胞中HDAC1蛋白表达。(3)构建不含HDAC1 mRNA 3′UTR区的真核表达载体pcDNA3.1-HDAC1,将pcDNA3.1-HDAC1与miR-34a mimics共同转染HL-60细胞。结果显示将pcDNA3.1-HDAC1与miR-34a mimics共转染HL-60细胞后,细胞的凋亡率显著降低,而将miR-34a mimics转染细胞后,细胞的凋亡率显著升高。这提示将不含3’UTR的pcDNA3.1-HDAC1转染到HL-60细胞后,能够回复miR-34a引起的促凋亡作用。miR-34a是通过作用HDAC1 3’UTR种子区结合,发挥促凋亡抑制作用。结论:1、AML细胞族HL-60中过表达miR-34a显示细胞的增殖活力降低,凋亡率升高;而抑制miR-34a抑制细胞凋亡。miR-34a能够促进AML细胞凋亡,发挥抑癌基因的作用。2、HDAC1是miR-34a的靶基因,miR-34a通过与HDAC1 mRNA的3’UTR区结合,促进HL-60细胞的凋亡。
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