生鲜鸡肉产品是肉鸡经过养殖、屠宰、加工、运输、贮藏和销售的一类生肉制品,其在全生产链中存在广泛的微生物直接暴露风险和交叉污染风险。葡萄球菌作为广泛分布于动物表面的潜在致病菌,其在生鲜鸡肉产品中的致病特性直接关系到消费者的健康。因此,调查生鲜鸡肉产品中的葡萄球菌污染情况,研究其潜在致病性,对制定针对性控制措施、开发靶向抑制策略具有重要意义。本研究基于不同销售环境、贮藏温度、包装方式和产品形态,对生鲜鸡肉产品中的葡萄球菌进行分离鉴定,应用多种分子分型方法对分离菌株进行分子分型,并通过耐药性鉴定、毒力基因鉴定以及产生物膜能力评估其潜在致病性。针对血浆凝固酶阴性葡萄球菌具有为金黄色葡萄球菌提供耐甲氧西林基因组件的特性,本研究基于密码子使用的偏好性,对葡萄球菌基因组和耐甲氧西林基因mecA的密码子进行对比,以期寻找基因mecA的来源。针对金黄色葡萄球菌具有产“超级抗原”-肠毒素的特点,探讨鸡肉中潜在刺激因子对金黄色葡萄球菌产肠毒素能力的影响,通过基因调控通路分析,寻找鸡肉潜在刺激因子存在条件下调控肠毒素基因表达的关键调控因子。主要研究内容和结果如下:1.生鲜鸡肉产品中金黄色葡萄球菌的污染及致病性研究调查不同生鲜鸡肉产品的金黄色葡萄球菌污染率、污染水平、耐药性(包括动物常规用抗生素和医院治疗用抗生素)和生物膜形成能力,评估不同生鲜鸡肉产品的金黄色葡萄球菌污染情况以及潜在感染能力。通过收集市售464份生鲜鸡肉产品,应用国标方法对生鲜鸡肉中的金黄色葡萄球菌进行定性和定量,并进行生物膜形成能力测定和耐药性鉴定。结果显示金黄色葡萄球菌在生鲜鸡肉产品中的总污染率为11.5%,对比不同销售环境和产品类型,超市和菜场的污染率无显著差异(p>0.05),而带皮产品和分割产品的污染率分别显著高于去皮产品和全胴体(p<0.05),不同产品的金黄色葡萄球菌污染水平维持在102-104 CFU/g,此外,耐药性鉴定表明青霉素和四环素抗性在分离菌株中具有广泛分布,不同来源对比表明盘尼西林和四环素抗性菌株主要分布于带皮产品和分割产品,而带皮产品的分离菌株表现出极强的产生物膜能力,本实验结果表明生鲜鸡肉加工阶段的分割操作和包装方式是引起金黄色葡萄球菌污染的主要因素。2.生鲜鸡肉产品中金黄色葡萄球菌的分子分型及毒力基因鉴定采用多种分子分型技术(包括MLST、spa分型和agr分型)对生鲜鸡肉产品中的金黄色葡萄球菌分离菌株进行分型,并对分离菌株的毒力基因进行分子鉴定,实现对分离菌株在生鲜鸡肉产品环境中的流行特性和潜在毒力特征的全面分析。结果显示CC5在所有产品中均有分布,而spa分型并未在MLST基础上对分离菌株出现进一步的区分,不同产品中的对比表明CC5可能来源于生产环境,而CC12来源于销售环境,带皮产品具有更为多样的分子型,agrⅡ、Ⅲ型的集中分布表明不同分子型间可以共用信号因子,进而实现毒力基因调控的同步进行。毒力基因鉴定显示典型毒力因子如pvl、tst和典型肠毒素基因等具有较低的阳性率,表明毒素型金黄色葡萄球菌在生鲜鸡肉产品中具有较低的存在率,而非典型肠毒素基因的广泛分布也值得引起人们的重视。不同产品间的对比表明超市环境中的分割和带皮产品分离菌株具有较高的肠毒素基因阳性率,且菜场环境的分离菌株肠毒素基因阳性率最高,这暗示分割和销售是引起致病性金黄色葡萄球菌污染的主要因素。3.零售生鲜鸡肉中血浆凝固酶阴性葡萄球菌的致病性研究过去针对肉中分离的血浆凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-Negative Staphylococci,CNS)的研究认为CNS通过其他细菌获得水平转移元件(如毒力和耐药因子)。本研究针对零售市场180份生鲜鸡肉样品中分离的CNS进行污染率、同源性和致病性研究。CNS的整体污染率为11.7%,不同来源的样品(包括不同零售环境、供应商和产品)CNS污染集中于69.2%的Staphylococcus epidermidis和30.8%的S.warneri。分子分型显示同菌种具有较高的同源性。耐药敏感试验显示CNS具有普遍的盘尼西林和红霉素抗性,其中,17株S.epidermidis分离菌株呈现庆大霉素-卡那霉素-盘尼西林-红霉素(GM-K-P-E)多重耐药性,一株耐甲氧西林S.epidermisdi分型为Staphylococcal Cassette Chromosome(SCC)mee V。总的来说,不同来源的生鲜鸡肉产品呈现集中的S.epidermidis和S.warneri污染,同菌种间具有较高的同源性。尽管CNS的毒力基因鉴定呈现阴性,然而考虑人类健康和感染问题,S.epidermidis分离菌株频繁出现的多重耐药性以及CNS中盘尼西林-红霉素抗性需要获得高度重视。4.基于葡萄球菌密码子偏好性分析耐甲氧西林基因mecA的来源作为葡萄球菌染色体盒(Staphylococci Casstte Chromosome mec,SCCmec)的核心元件,基因mecA赋予SCCmec耐甲氧西林的特性,在葡萄球菌中具有广泛的分布,对感染后的患者造成关键的致命性。然而,mecA的来源目前仍然不明确。通过从葡萄球菌全基因组序列中提取mecA基因,对比了 mecA和葡萄球菌全基因组的密码子偏好性,以及mecA密码子和葡萄球菌基因组tRNA的反密码子匹配性,结果表明mecA点突变对密码子偏好性无影响,mecA和葡萄球菌的相对同义密码子使用(Relatively Synonymous Codon Usage,RSCU)对比表明mecA具有明显的葡萄球菌属内传播特征,mecA和tRNA的密码子和反密码子匹配结果表明S.haemouslytic极可能是mecA的祖代携带者,全基因组发育树显示耐甲氧西林葡萄球菌具有较近的基因关系,特别是普遍存在耐甲氧西林葡萄球菌S.aureus 和S.haemolyticus。综上所述,根据mecA和葡萄球菌基因组的密码子对比结果,推测S.haemolyticus具有mecA初始菌种的特征。5.鸡肉、蛋白质和维生素B2对金黄色葡萄球菌肠毒素基因表达的影响本研究通过对比不同培养基质(包括肉质和TSB)中金黄色葡萄球菌的生长、肠毒素表达情况,结果显示鸡肉基质在不影响细菌生长的情况下,具有显著提高肠毒素基因表达的刺激作用(p<0.05),且位于质粒和致病岛的肠毒素b、c和d具有随细胞紧密表达的特点。通过进一步对比不同营养刺激(维生素B2、蛋白质)下的肠毒素基因表达变化,利用STEM对不同环境下的调控基因以及肠毒素基因时序性表达进行分析。结果表明,尽管试验菌株均具有相关调控基因,然而不同菌株具有不同的调控偏好性,表明细菌的调控网络比目前研究获得的结果要复杂得多。依据大量研究总结出的假定调控网络,细菌在高氮源/碳源的情况下,会优先选择具有能量代谢通路的调控,进行大量生长繁殖,具有能源充足条件下优先选择生长的特性,而不会选择上调毒力基因提高其在环境中的竞争能力。在环境中含有具有提高其代谢利用率如维生素B2的条件下,细菌会在相对有限的能源条件下,优先提高其毒力基因表达,以提高其环境竞争能力。