论文部分内容阅读
目的:ELL-相关因子2(EAF2)是前列腺癌中重要的肿瘤抑制因子,然而其抑癌作用的具体机制尚不清楚。蛋白间的相互作用是调控其功能的重要方式之一。本研究拟通过筛选并鉴定前列腺癌中与EAF2相互作用的蛋白,探讨EAF2调控雄激素受体活性及前列腺癌细胞增殖、迁移的分子机制。方法:应用线虫(C.elegans)模型进行RNAi筛查,寻找与eaf-1发挥协同作用的基因。应用免疫共沉淀实验验证EAF2与筛选蛋白的结合情况。通过realtime PCR和剂量依赖共表达实验研究EAF2对所选蛋白表达的调控作用及机制。利用si RNA基因干扰技术对前列腺癌细胞中EAF2和所选蛋白进行单独敲除或双敲除,realtime PCR和双荧光素酶报告基因检测AR下游基因的表达水平以明确AR转录活性变化;染色质免疫共沉淀实验检测EAF2和筛选蛋白相互作用对AR与下游基因DNA结合能力的影响;Brd U、克隆形成实验和transwell细胞迁移实验检测细胞增殖和迁移能力的改变。结果:以线虫生育能力作为参考指标,我们筛选出5个与eaf-1(人类EAF2基因的C.elegans同源基因)具有协同作用的基因,分别为lin-53,pha-4,hmg-1.2,ruvb-1和set-6,其中pha-4的人类同源基因FOXA1在前列腺癌进展中具有重要作用,因此我们选择其作为后续研究基因。在前列腺癌细胞中,EAF2与FOXA1相互结合。敲除前列腺癌细胞LNCa P中的EAF2能够上调内源性FOXA1的蛋白水平,过表达EAF2则能降低FOXA1的表达。EAF2对FOXA1的m RNA表达无影响。敲除LNCa P细胞的EAF2表达能够上调AR下游基因表达水平,促进AR与ARE结合,并增强细胞的增殖和迁移能力;对FOXA1和EAF2进行双敲除则能够抵消单独敲除EAF2对AR下游基因表达、AR同ARE的结合、LNCa P细胞增殖和迁移能力的促进作用。表明FOXA1在EAF2对AR转录活性、细胞增殖和迁移的调控中起介导作用。结论:在EAF2调控前列腺癌细胞AR信号通路、细胞增殖和迁移能力的过程中,FOXA1发挥了重要的介导作用。