胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,成为危害居民健康的主要疾病。目前,医学界对于胃癌缺乏理想的根治方法,因此,对胃癌发病机制的研究有着深远的理论价值和临床意义。体细胞端粒酶的激活是肿瘤发生发展的重要因素之一,85%~90%肿瘤细胞中端粒酶基因激活,使肿瘤细胞获得永生化。端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是端粒酶的限速亚单位,对端粒酶的活性起到直接调控作用。因此,hTERT活化引起端粒酶激活是肿瘤细胞恶性转化并无限增殖的重要环节。既往关于hTERT的调控研究多集中于转录水平,而转录后水平的研究较少。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类内源性非编码小分子RNA,参与基因转录后水平的调控,在包括肿瘤发生和转移在内的许多病理和生理过程中起到十分重要的作用。研究表明,一些miRNA可以直接或间接调控hTERT的表达水平,从而影响肿瘤的疾病进程。但目前关于微小RNA 155(microRNA 155,miR-155)对hTERT的调控机制及作用研究还鲜有报道。因此,本研究采用生物信息学预测软件TargetScan和Miranda预测specificity protein 1(SP1)和E2F transcription factor 2(E2F2)mRNA 3′-非翻译区(3′-UTR)是否是人miR-155的作用靶点。针对SP1和E2F2mRNA 3′-UTR设计互补的两条寡核苷酸,包括目标序列(即SP1、E2F2野生型序列)及突变序列(SP1-mu、E2F2-mu),构建SP1和E2F2 mRNA3′-UTR报告基因载体p MIR-SP1、pMIR-E2F2、pMIR-SP1-mu和pMIRE2F2-mu。培养HEK-293细胞,采用脂质体法将SP1和E2F2的野生型和突变型pMIR-Luc质粒共转染HEK-293细胞24 h。将细胞分为SP1空白对照组、SP1目标序列组、SP1突变序列组、E2F2空白对照组、E2F2目标序列组、E2F2突变序列组,均加入0.2μg重组质粒、0.01μg对照质粒和0.375μl寡核苷酸,培养24 h。采用双荧光素酶报告基因系统检测双荧光素酶活性,以萤火虫荧光素酶活性值(Firefly luciferase activity value)/海肾荧光素酶活性值(Renilla luciferase activity value)比值评价miR-155与SP1及E2F2 mRNA 3′-UTR结合效果。培养SGC-7901细胞,采用脂质体法将miRNA control、miR-155 mimics、miR-155inhibitors分组转染SGC-7901细胞24h,采用实时定量PCR和Western blot验证miRNA-155在胃癌细胞中对靶基因及hTERT表达的影响。研究发现,在线预测结果示,SP1 mRNA及E2F2 mRNA 3′-UTR均有与miRNA-155完全互补配对的序列,预测二者均为miRNA-155的靶基因。经测序鉴定,SP1和E2F2报告基因重组质粒构建成功。双荧光素酶实验结果显示,SP1目标序列组F/R低于SP1空白对照组及SP1突变序列组(P均<0.05),E2F2目标序列组F/R低于E2F2空白对照组及E2F2突变序列组(P均<0.05)。细胞实验过表达miR-155,通过实时定量PCR和Western blot验证了miR-155在细胞内能与靶基因SP1的mRNA 3′-UTR互补结合,可抑制SP1的表达水平(P<0.05),进而抑制hTERT的表达(P<0.05),在胃癌细胞hTERT的机制通路中起到调控作用。本实验成功预测并验证了miR-155在胃癌细胞调控hTERT的部分靶基因,表明miR-155通过作用于SP1等在端粒酶激活和肿瘤发生过程中发挥重要作用的转录因子,参与调控胃癌细胞hTERT表达水平的生物进程。miR-155作为新的负反馈调节因子,与靶基因共同构成全新的基因调控网络,参与胃癌细胞hTERT表达的调节过程,为胃癌的致病机制研究提供了新的方向。