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杠柳（Periploca sepium Bunge）是萝藦科（Asclepiadaceae）杠柳属的一种蔓生性灌木,又名北五加、香加皮、羊角桃,分布于我国大部分地区,资源丰富。在我国为一种重要的中药材,其药理作用显著,具有抗炎、强心、抗癌等作用。近年来,本实验室从杠柳根皮提取物中发现系列的糖苷类杀虫活性成分,主要有杠柳毒素NW及杠柳新苷P和T等。进一步研究表明杠柳新苷类杀虫活性化合物的主要作用部位为昆虫中肠,腹部肿胀为其最典型的中毒症状。目前,国内外研究中,除Bt和苦皮藤素外,仅杠柳新苷类被发现为作用于昆虫中肠的另一种植物源农药。但是,杠柳新苷类杀虫活性化合物引发昆虫的典型中毒症状与Bacillus thuringiensis（Bt）和苦皮藤素完全不同。至今,其对昆虫的杀虫机理尚不清楚。因此,本研究以东方粘虫幼虫（Mythimna separata Walker）为供试昆虫,通过定量差异蛋白组学技术对杠柳新苷类杀虫活性化合物的作用靶标进行鉴定,并借助酶学、真核表达体系构建、同源模建、定点突变和体外结合等手段对鉴定得到的疑似靶标蛋白进行了系统深入的研究。主要结果如下:1.基于定量差异蛋白质学技术（2-DE）获得了杠柳新苷P（PSP）作用于东方粘虫中肠刷状绝缘囊泡（BBMV）上的差异表达蛋白。通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间质量分析质谱技术（MALDI-TOF/TOF）分析鉴定得到11个差异表达蛋白,分别为转铁蛋白（transferin）、二硫化物异构酶前体（protein disulfide isomerase precursor）、钙网蛋白（calreticulin）、原肌球蛋白同工型（tropomyosin-2 isoform 4）、V型ATP酶A亚基（V-type ATPase A subunit）、丝氨酸蛋白酶（diverged serine protease）、类胰蛋白酶（trypsin-like protease）、39S核糖体蛋白（39S ribosomal protein L46,mitochondrial-like）、法尼酸O-甲基转移酶（farnesoic acid O-methyltransferase）、氨肽酶N1（aminopeptidase N1）和热激蛋白72（heat shock protein cognate 72）。进一步利用生物信息学手段分析了以上差异表达蛋白的细胞功能,利用STRING软件对其进行了GO富集分析。综合前期的症状学观察及组织病理学结果分析,推测V-ATP酶A亚基和氨肽酶可能为杠柳新苷类化合物的疑似靶标。2.采用载毒叶片饲喂法测定6个杠柳新苷类化合物对3龄粘虫幼虫的毒力,结果表明杠柳新苷P（PSP）和杠柳新苷T（PST）对3龄粘虫幼虫表现出较强的杀虫活性,其24 h的LC50（致死中浓度）分别为1.60和1.23 mg/mL,杠柳新苷A（PSA）、杠柳新苷D（PSD）和杠柳新苷F（PSF）仅表现出微弱的杀虫活性,其24 h的LC50值分别为28.68、22.44、21.31 mg/mL,而杠柳新苷E（PSE）则无明显杀虫活性。对东方粘虫幼虫中肠细胞BBMV中三种特征酶氨肽酶、碱性磷酸酶及V-ATPase活性影响的测定表明6个杠柳新苷类化合物对氨肽酶和碱性磷酸酶活性均没有明显的抑制作用,而杀虫活性化合物PSP和PST可浓度依赖方式地显著地抑制V-ATPase的活性。因此,推测杠柳新苷类杀虫活性化合物的初始作用位点位于V-ATP酶A亚基上。3.基于昆虫杆状病毒真核表达系统的蛋白质表达技术,成功构建了由pBacPAK9作为表达载体的真核表达系统,且该系统诱导表达的目的重组蛋白在细胞裂解液的上清中呈可溶状态。荧光猝灭光谱测定结果表明,杠柳新苷类化合物PSA、PSD、PSE、PSF、PSP和PST与野生型重组蛋白pBacPAK9/VatpA相互作用形成复合物引起静态猝灭,其结合常数Ka分别为0.81×105、1.42×105、0.50×105、1.62×105、6.95×105和4.4×105L·mol-1。等温滴定量热法（ITC）得到PSA、PSD、PSE、PSF、PSP和PST滴定野生型重组蛋白的结合常数Ka分别为1.86×105、2.48×105、1.35×105、2.67×105、9.25×105和8.27×105 L·mol-1。这些结果表明杠柳新苷类化合物的杀虫活性与其和野生型重组蛋白pBacPAK9/VatpA的结合能力具有显著相关性。4.以啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）V-ATPase A亚基X-ray得到的三维结构（其PDB ID编号为:5BW9.1）为模板,通过Swiss-Model软件对东方粘虫幼虫中肠V-ATPase A亚基进行了同源模建。基于同源模建后的三维模型,通过SYBYL软件对V-ATPase A亚基模型的活性结合腔进行了预测和定义,发现V-ATPase A亚基模型的表面存在两个潜在的活性结合腔（A和B）,进而将供试的杠柳新苷类化合物与活性结合腔A和B分别进行了柔性分子对接,并预测东方粘虫幼虫中肠V-ATP酶A亚基活性腔中的Lys85、Arg171、Glu199、Gln207、Val208、Pro226、Gln242和Arg400八个氨基酸残基可能为杠柳新苷类活性化合物的结合位点。5.对预测的东方粘虫V-ATPase A亚基活性位点中的8个氨基酸残基进行了两组突变处理。一组为丙氨酸突变,即将8个氨基酸残基均替换为丙氨酸,分别为K85A、R171A、E199A、Q207A、V208A、P226A、Q242A和R400A;另一组,根据氨基酸本身的性质（酸碱性、极性、电荷等）,对8个氨基酸进行变义氨基酸残基替换,分别为K85D、R171D、E199K、Q207T、V208G、P226S、Q242T、R400D。基于Bac-to-Bac/BmNPV的昆虫杆状病毒真核表达系统成功构建了16个突变体重组蛋白的表达体系。突变体重组蛋白在细胞裂解液的上清中均呈可溶状态,进而采用Ni-NTA His?Bind Resin column获得纯化的突变体重组蛋白。6.基于荧光猝灭光谱和ITC分别研究了PSP和PST与8个丙氨酸（Ala）突变体蛋白和8个错义突变体蛋白之间的结合常数。定点突变验证结果表明东方粘虫幼虫中肠V-ATPase A亚基上存在杠柳新苷类杀虫活性化合物的结合位点,预测的活性结合腔A上的K85、R171为杠柳新苷类杀虫活性化合物的结合位点。