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背景:糖尿病是一种以胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍引起机体血糖升高为特征的代谢性疾病,它可以引起心、脑、肾及视网膜等重要靶器官损害,其中糖尿病冠状动脉病变尤为严重,可引起心肌梗死、心律失常,甚至心源性猝死。大电导钙激活钾离子通道(large conductance calcium activated K+channels,BK通道)是冠状动脉平滑肌上分布最多的钾离子通道,对血管平滑肌细胞静息膜电位和血管张力具有重要调节作用。近年来,有研究表明二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)具有抗心律失常、降脂降血压和预防心肌梗死等心血管系统保护作用,但具体机制尚不明确,可能与激活冠状动脉平滑肌细胞BK通道有关。目的:探讨DHA对糖尿病大鼠冠状动脉功能的影响及其机制。方法:(1)采用腹腔注射链脲霉素建立1型糖尿病大鼠动物模型,予每日0.1 g DHA灌胃8周建立灌胃大鼠模型;(2)采用微血管张力测定技术检测在BK通道抑制剂伊比蝎毒素(iberiotoxin,IBTX)未孵育和孵育条件下,不同浓度DHA对正常组和糖尿病组冠状动脉舒张功能的影响;检测BK通道抑制剂IBTX和激动剂NS1619对DHA灌胃大鼠冠状动脉收缩和舒张功能的影响;(3)采用三步酶消化法分离DHA大鼠冠状动脉平滑肌细胞;(4)采用单通道膜片钳实验技术记录直接灌流不同浓度DHA后,正常组和糖尿病组冠状动脉平滑肌细胞BK通道开放概率(NP0)的变化;记录DHA灌胃后大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道NP0变化;(5)采用qRT-PCR实验技术检测DHA灌胃后大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道亚单位基因表达;(6)采用Western blotting实验技术检测DHA灌胃后大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道亚单位蛋白表达。结果:(1)成功建立1型糖尿病组动物模型,造模前后大鼠体重水平为(190.75±4.32)和(248.89±18.41)g(P<0.05,n=60);血糖水平为(7.29±0.31)和(30.21±1.35)mmol/L(P<0.05,n=60),造模成功率91.6%;(2)内皮素1(ET-1)收缩正常组和糖尿病组冠状动脉后,0.1 mol/L、1 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/几、30 μmol/L和100 μmol/L DHA对正常组冠状动脉舒张比例为(3.01±1.65%)、(4.22±2.45%)、(4.44±2.94%)、(20.89±3.34%)、(50.27±6.37%)和(68.54±8.63%)(P<0.05,n=13);糖尿病组舒张比例为(1.21±1.17%)、(1.44±2.93%)、(4.38±3.02%)、(10.66±3.86%)、(15.28±4.62%)和(36.82±5.83%)(P<0.05,n=13);(3)IBTX 孵育 30 分钟,0.1 μmol/L、lμmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol、L和100 μmol/L DHA对正常组冠状动脉舒张比例为(2.03±1.82%)、(2.52±1.14%)、(3.23±1.56%)、(3.18±2.34%)、(3.39±1.59%)和(9.58±2.63%)(P<0.05,n=5);糖尿病组舒张比例为(0.98±1.72%)、(0.77±1.69%)、(1.24±1.57%)、(1.17±1.52%)、(1.68±2.62%)和(1.57±1.34%)(P>0.05,n=5);(4)分别使用血管收缩剂KCl和IBTX收缩正常组、DHA灌胃正常组、糖尿病组、DHA灌胃糖尿病组冠状动脉,四组血管IBTX/KCl%依次为(79.24±4.36%)、(87.25±2.13%)、(29.81±4.08%)和(70.73±5.27%)(P<0.05,n=12);(5)加入KC1,正常组、DHA灌胃正常组、糖尿病组、DHA灌胃糖尿病组冠状动脉收缩到最大值稳定后,NS1619对四组冠状动脉舒张比例分别为(46.89±7.80%)通道膜片、(48.59±4.00%)、(15.28±2.21%)和(44.04±3.1 1%)(P<0.05,n=8);(6)在单钳记录模式下,分别灌流0 μimol/L、0.01 μmol/L、0.03 μmol/L、0.1 μmol/L、0.3 μmol/L、1 μmol/L、3 μmol/L、5 μmol/L 和 10 μmol/L DHA,正常组冠状动脉平滑肌细胞BK通道NP0分别为(0.091±0.009)、(0.090±0.0102)、(0.093±0.092)、(0.098±0.0091)、(0.099±0.013)、(0.101±0.025)、(0.3712±0.0456)、(0.751±0.029)和(0.866±0.046)(P<0.05,n=5);糖尿病组BK 通道 NP0 分别为(0.016±0.011)、(0.015±0.010)、(0.017±0.013)、(0.016±0.0017)、(0.019±0.0112)、(0.018±0.020)、(0.153±0.021)、(0.3127±0.019)和(0.450±0.025)(P<0.05,n=5);(7)在刺激电位20 mV、40 mV、60 mV、80 mV 和 100 mV 条件下,正常组 BK 通道 NP0为(0.004±0.001)、(0.023±0.009)、(0.254±0.055)、(0.667±0.042)和(1.109±0.034)(P<0.05,n=10);DHA 灌胃正常组 BK 通道 NP0 为(0.006±0.001)、(0.039±0.013)、(0.302±0.002)、(0.779±0.050)和(1.295±0.051)(P<0.05,n=10);糖尿病组 BK 通道 NP0 为(0.000±0.001)、(0.001±0.002)、(0.014±0.004)、(0.072±0.027)和(0.270±0.021)(P<0.05,n=10);DHA 灌胃糖尿病组 BK 通道 NP0 为(0.006±0.000)、(0.023±0.006)、(0.150±0.050)、(0.428±0.015)和(0.896±0.042)(P<0.05,n=10);(8)正常组、DHA灌胃正常组、糖尿病组和DHA灌胃糖尿病组大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道α亚单位(BK-α)基因相对表达分别为(1.37±0.19)、(1.34±0.06)、(1.27±0.13)和(1.39±0.19)(P>0.05,n=8);BK 通道β1 亚单位(BK-β1)基因相对表达分别为(1.25±0.15)、(1.28±0.12)、(0.77±0.13)和(0.78±0.10)(P<0.05,n=8);(9)正常组、DHA 灌胃正常组、糖尿病组、DHA灌胃糖尿病组冠状动脉平滑肌细胞BK-α蛋白相对表达分别为(1.21±0.06)、(1.10±0.08)、(1.07±0.08)和(1.12±0.10)(P>0.05,n=8);BK-β1 蛋白相对表达分别为(1.22±0.04)、(1.18±0.04)、(0.20±0.03)和(1.148±0.07)(P<0.05,n=8)。结论:(1)糖尿病时冠状动脉平滑肌细胞BK通道NP0减少,BK-β1基因和蛋白表达减少,这可能是糖尿病冠状动脉血管功能受损的重要机制;(2)DHA对正常和糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK通道均具有激活作用,且呈浓度依赖性,但DHA对正常冠状动脉平滑肌细胞BK通道的激活作用比糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK通道的激活作用更强;DHA灌胃可以增加糖尿病时冠状动脉平滑肌细胞BK通道NP0;(3)DHA对正常冠状动脉和糖尿病冠状动脉均具有舒张作用,且具有浓度依赖性,但DHA对正常冠状动脉的舒张作用更强;孵育IBTX后,DHA的对血管的舒张作用被抑制;DHA灌胃可以改善受损的糖尿病血管功能;(4)糖尿病时BK通道NP0减少,冠状动脉舒张功能下降,提示冠状动脉功能受损,DHA可通过提高糖尿病冠状动脉BK-β1蛋白表达,激活BK通道,增加BK通道NPo,舒张血管,从而保护糖尿病冠状动脉功能。