基因组的表达调控主要受到染色质结构变化的影响，而染色质结构的变化则是由组蛋白的翻译后修饰和DNA甲基化调控等表观遗传修饰所控制的。在真核生物中，DNA甲基化修饰是调控基因表达的一个重要的表观遗传学标志。在类病毒感染的烟草中首先被发现的RNA介导的DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation, RdDM），则是植物在非生物胁迫下引起转录水平基因沉默（transcriptional gene silencing, TGS）的一个重要调控机制。小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的存在与缺失直接影响了其对应的沉默位点的mRNA表达丰度的高低。大约三分之一的DNA甲基化位点是富含siRNA靶向位点的，暗示了siRNA在DNA甲基化修饰中的重要作用。并且越来越多的实验证据证明了siRNA可以被多种外界胁迫所诱导进而影响其靶向的位点染色质结构。虽然非生物胁迫中的脱落酸（abscisic acid,ABA）依赖的盐胁迫信号转导途径已经研究的比较深入，但是DNA甲基化和去甲基化修饰是否参与到这个调控过程中仍不是十分清楚，并且siRNA是如何通过RdDM来响应外界非生物胁迫的作用机理也需要深入研究。本研究通过对AtMYB74基因的系统分析，证明RdDM参与到了植物ABA依赖的盐胁迫调控信号途径，进一步揭示了非生物胁迫下siRNA在RdDM过程中调控基因表达的作用机理。主要研究结果和主要结论如下：（1）AtMYB74基因编码一个R2R3型MYB转录因子通过对GENEVESTIGATOR和Arabidopsis eFP Browser数据库的分析，发现了1286个响应盐胁迫调控的基因。然后利用拟南芥表观遗传学图谱，对它们的启动子DNA甲基化情况进一步分析，鉴定出可能被DNA甲基化修饰调控响应盐胁迫的候选基因，最终选定AtMYB74作为研究对象进行深入探索。对转录物序列分析发现，AtMYB74的mRNA全长包含975个碱基，编码一条324个氨基酸的多肽链。其13位至65位和66位至117位氨基酸编码MYB转录因子家族保守的R2和R3DNA结合结构域，与拟南芥及其他植物物种的MYB家族同源。经过qRT-PCR和GUS染色分析，发现AtMYB74基因在拟南芥各组织器官中特异表达且丰度较低。通过洋葱表皮的瞬时转化实验在细胞核中观察到AtMYB74-GFP融合蛋白的GFP荧光，证明AtMYB74蛋白的亚细胞定位是在细胞核中。（2）超表达AtMYB74转基因植株在种子萌发期对ABA和盐胁迫敏感超表达AtMYB74可以诱导AtRD29B、AtRAB18和AtRD20等盐胁迫响应基因的表达。在NaCl和ABA的处理下，AtMYB74超表达转基因植株的种子萌发率较野生型明显下降；而RNAi转基因植株的种子萌发率则与野生型无差别。当在NaCl处理下添加ABA合成抑制剂钨酸钠时，超表达植株的敏感表型则会部分恢复。由此，萌发率的敏感表型证明了AtMYB74是在种子萌发期间通过ABA依赖的信号途径对盐胁迫进行响应进而行使其生物学功能的。（3）盐胁迫条件下DNA甲基化修饰调控AtMYB74的转录活性在NaCl和ABA处理的野生型中，AtMYB74的基因转录水平有明显的升高，证明AtMYB74是在转录水平上响应盐胁迫。而在RdDM突变体中，AtMYB74的mRNA表达水平变化远不如野生型中明显；同时，DNA去甲基化RNAi转基因植株中，同样处理下也显示出同样的结果，证明RdDM修饰对AtMYB74的转录起调控作用。对AtMYB74转录起始位点上游200个碱基区（-700~-500）域进行亚硫酸氢盐处理测序PCR（bisulfitesequencing PCR, BSP）结果发现，存在NaCl和ABA时，野生型中该区域的5-甲基胞嘧啶含量比对照组有明显升高。值得注意的是，CpHpH位点的胞嘧啶甲基化所占百分比下降了接近一半，而CpG位点只降低了10%。而在RNAi转基因植株中只是在所有位点的胞嘧啶甲基化程度出现轻微下降。通过对不同时间点的AtMYB74表达量及其启动子CpHpH位点DNA甲基化的检测，发现在盐胁迫处理后从0.5小时开始AtMYB74的表达量出现上升，在3小时时达到峰值，从6小时开始有轻微下降但仍维持在明显高于对照组的水平；而对应的CpHpH位点的DNA甲基化水平也是从0.5小时开始下降，在3小时时达到最低值，随后处在低于对照组的水平。同样的结果在ABA处理组中也被检测到，证明盐了胁迫对AtMYB74的表达量诱导升高是通过动态的CpHpH位点DNA甲基化修饰所调控的。（4）靶向AtMYB74启动子的24-nt siRNA的积累影响DNA甲基化序列分析发现，5条24-nt siRNA（ASRP215119、ASRP41948、ASRP27256、ASRP13208、ASRP2423）均可以靶向AtMYB74启动子-603位至-447位区域的相应位点。经过BSP分析后发现，盐胁迫下DNA甲基化的变化位点也是发生在这一区段或临近位置。但不论是在5-azaC处理的野生型中，还是在RdDM突变体以及去甲基化RNAi转基因植株中，都不会因为盐胁迫的存在而使这一区段的DNA甲基化水平发生明显变化，由此证明这一区段的CpHpH位点DNA甲基化修饰具有重要调控作用。通过siRNAqRT-PCR和siRNA Northern Bolt杂交检测实验，也发现靶向这一区段的5条24-nt siRNA的积累量在盐胁迫下会明显下降。而在对照组dcl3突变体中，因为siRNA合成途径被阻断则检测不到24-nt siRNA积累量变化。因此，盐胁迫是通24-nt siRNA的表达量减少来降低DNA甲基化的修饰作用，进而激活的AtMYB74基因表达的。（5）外源表达24-nt siRNA促进AtMYB74启动子DNA甲基化通过pFGC5941表达载体可以产生发夹结构的双链RNA进而生成siRNA的特性，本研究构建了可以分别产生靶向AtMYB74启动子和cDNA的siRNA的表达载体，命名为R1和R2。同样以GUS作为检测对象，构建了35S启动子、AtMYB74启动子和缺失siRNA靶向区段的AtMYB74启动子的pBI121表达载体，命名为P1、P2和P3。通过瞬时共转化实验，发现P1-R1组对应P1组，P2-R2组、P3-R1组对应P2组都没有明显GUS活性变化，而存在siRNA直接靶向的P2-R1组则比对照P2组的GUS活性明显降低。同样经过BSP检测发现，P2-R1组在该靶向区段的DNA甲基化水平升高了43%，而其他组则无明显变化。上述结果证明异源表达人工合成的siRNA可以在瞬时共转化时靶向AtMYB74启动子，同样可以通过RdDM调控对应GUS表达，从另一方面证明了siRNA对于RdDM调控的重要作用。（6）RdDM和ABA响应元件（ABA-responsive cis-elements,ABRE）均调控AtMYB74参与的盐胁迫的信号途径序列分析发现，AtMYB74启动子含有ABRE顺式作用元件，通过CHIP-PCR的方法验证了ABI5转录因子可以结合AtMYB74启动子上的ABRE顺式作用元件。尽管盐胁迫下abi5突变体中AtMYB74的转录本仍然会增加，但增加水平远低于野生型，并且含有P3载体的转基因拟南芥的GUS染色变化也说明ABRE顺式作用元件参与到了AtMYB74的调控中。同样在abi5突变体中检测到了CpHpH位点DNA甲基化水平的降低和靶向启动子的siRNA积累量下降。这些结果证明ABRE顺式作用元件和RdDM途径均参与了AtMYB74响应盐胁迫的调控。