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海水养殖动物的弧菌病（Vibrio）是一种流行范围广,危害严重的传染性疾病。其中灿烂弧菌是致病菌之一。灿烂弧菌是海水动物的重要致病菌,可引发大菱鲆、牙鲆、大西洋鲑、鳟鱼、鲈鱼等患多种疾病,可引起尾部有出血点,皮肤腐烂,严重的形成溃疡;背鳍、胸鳍、尾鳍的鳍条基部充血;肝脏肿大,糜烂;肾脏糜烂等症状。还可引起刺参腐皮综合征。弧菌溶血素被认为是主要的致病因子之一。但是,针对于灿烂弧菌致病因子的相关研究报道较少。国外曾有针对灿烂弧菌的金属蛋白酶缺失自杀载体的试验研究报道,但以灿烂弧菌的溶血素基因4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase（4HPPD）为对象的研究尚未见报道。本研究以纯化的灿烂弧菌外毒素和灿烂弧菌溶血素基因4HPPD原核表达蛋白为对象,以此菌致病的致病因子进行了分析。获得的结果如下:1青岛某美国红鱼养殖场中患溃烂症的美国红鱼分离到优势菌株QD-1,人工感染实验证实该菌为美国红鱼的致病菌。对该细菌进行了形态学、生理生化特性分析,同时对菌株QD-1进行了分子生物学的鉴定,命名为灿烂弧菌QD-1菌株（Vibrio splendidus QD-1）。2细菌致病性的检测:溶血性测定:将脱纤维羊血按5%的体积加入Zobell 2216E海洋培养基中制成羊鲜血平板,28℃过夜培养。菌落周围出现半径为2mm溶血环。磷脂酶活性测定:配制Zobell 2216E固体培养基,加入体积分数为1%的新鲜蛋黄,制成平板。在菌落周围出现半径为0.5mm乳白色半透明圈。从以上两个实验中可以看到灿烂弧菌的溶血性较强,而磷脂酶的活性测较弱,这可能是与菌株的不同有关。人工感染实验:在水族箱中,每箱放养健康孔雀鱼10尾。致病性试验共分6组,5个实验组和1个对照组,每组10尾鱼,实验组的细菌浓度分别为2×104 cfu /mL,2×105 cfu /mL,2×106 cfu /mL,2×107 cfu /mL,2×108 cfu /mL,对照组为0.65%的灭菌生理盐水,采用腹腔注射,注射剂量0.20 mL/尾。饲养水温27.4℃-28℃,连续观察7 d,随时记录鱼的发病症状及死亡情况。应用简易Korbor’s法计算出LD50为5.62×105 cfu/mL。3灿烂弧菌挑取单个菌落接种50mL海水培养基中,于28℃增菌18h后,再按1%量转种至1L海水培养基中,200rpm,振荡48h。硫酸铵沉淀:培养物经离心取上清加入固体硫酸铵至70%的饱和度,离心后用浓度为50mmol/L的Tris-HCL （pH=7.8）缓冲液溶解,用相同缓冲液4℃透析48h,将其浓缩后即为粗提外毒素。Sephadex-G100层析:粗提外毒素加入Sephadex-G100层析柱中,用缓冲液洗脱,流速为6滴/min,每2mL收集一管,测定OD值,将最高峰值处的蛋白收集液,用PEG-100浓缩,即为纯化外毒素。经SDS-PAGE法测得分子量为40.7 kD。通过考马斯亮蓝法测得纯化蛋白的含量为0.8 mg/mL。取提纯溶血素作原液,10,100,1000倍稀释后无菌过滤,分四组。每一稀释度腹腔注射孔雀鱼5尾,每尾注射0.1mL,室温观察48h,记录实验鱼死亡数,按简易Korbor’s法计算LD50为6.35μg。结果表明,这是一株有致病性的灿烂弧菌。4将溶血素基因4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase （4HPPD）构建于表达载体pGEX-6P-I,经过一系列的条件摸索后,最终确定加入IPTG至终浓度0.8mmol/L,30℃,200rpm,振荡4h为最佳诱导条件。将纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗,将QD-1菌株纯化外毒素抗原稀释至16ug/mL,抗体稀释160倍测得P/N比值最大（阳性血清OD值为0.591,阴性对照值为0.058）。P/N=10。通过间接ELISA测定,免疫小鼠抗溶血素抗体滴度为1:3200。中和溶血素试验根据,将溶血素无菌过滤后分别分成10,100倍稀释组和纯化溶血素原液组,分别与20倍稀释免疫小鼠血清等量混合,室温作用1h。接种混合物的孔雀鱼,原液组全部死亡,10倍稀释抗原组死亡两尾,100倍稀释抗原组死亡1尾。