研究背景痛风是一种常见的尿酸结晶沉积在关节引起的关节炎,发达国家成年人患病率为1%-2%。近几十年来,随着饮食和生活方式的变化,我国痛风的患病率和发病率上升迅速。虽然痛风的发病机制尚不清楚,但遗传易感性被认为是一个重要因素。事实上,痛风的发病机制涉及遗传、环境和生活方式因素之间复杂的相互作用。因此,确定一个主要的痛风易感基因是迈向分子诊断成功的重要一步,并有助于痛风患者靶向治疗的发展。尽管目前痛风易感基因研究有了一些进展,识别许多其他未知基因有助于研究尿酸钠晶体的形成、急性痛风性关节炎及慢性痛风石。对大家族进行全基因组连锁研究及后续精细定位是鉴别主效基因的有效方法。课题组前期工作中,选择一个典型的痛风常染色体显性遗传家系作为研究对象,在微卫星引物D4S1572处获得最大似然概率值(LOD)值(LOD=1.50),表明该痛风家系的致病基因与该位点连锁,从而初步定位于4号染色体长臂2区5带(4q25)。此外台湾地区21个家系痛风全基因组连锁分析研究发现,染色体4q25区微卫星标记D4S2623与原发性痛风高度连锁[最大似然概率值(LOD)=4.29]。因此我们推测,染色体4q25区域某一基因可能在痛风发病中发挥重要作用。文献报道炎症/免疫应答和糖脂代谢相关基因的多态性位点在痛风的发病机制中起重要作用。染色体4q25区微卫星标记D4S1572与微卫星标记D4S2623之间共包括95个基因,有8个与炎症/免疫应答和糖脂代谢密切相关的基因未见与原发性痛风相关性报道。目的本研究分析确定中国汉族男性痛风患者中4q25区域致病基因,揭示新发现的痛风致病基因-表皮生长因子(EGF)在痛风炎症发病机制中的作用。研究对象和方法研究Ⅰ:1、研究对象第一阶段,我们共招募了480例男性痛风患者和480例正常男性对照。在第二阶段,我们收集1017例痛风男性患者和1897例正常对照用于展开精细定位研究。所有患者和正常对照个体都是无血缘关系汉族人。痛风的诊断根据1977年美国风湿病学会制订的痛风诊断标准,排除肾脏疾病、血友病等引起的继发性痛风。该研究得到当地伦理委员会批准及符合1975年赫尔辛基宣言,且所有参与者均签署知情同意书。2、基因分型每个受试者收集2毫升的外周血样本入已二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝管。使用全血DNA提取试剂盒提取基因组DNA。挑选4q25区(UCSC表格浏览器4q25定义在chr4:107700000-114100000,hgl9基因组序列)候选基因上标签单核苷酸多态性(tag SNP)用于评价候选基因区段与原发性痛风的相关性。第一阶段基因分型利用Illumina公司GoldenGate芯片技术及BeadStudio软件完成。原始基因型数据集包含960个样本和96个单核苷酸多态性的基因分型信息。按照自动聚类,这些单核苷酸多态性(SNP)位点根据GenTrain评分分类(从0到1)。根据Illumina公司的指导方针调整GenTrain评分为0.5分的SNP位点。排除应答率低于90%的样本和SNP位点。第二阶段应用MassArray系统对EGF和Elovl6基因上的93 tag SNPs进行基因分型。所有的操作流程都依据该系统的操作说明进行。应用15 ng的基因组DNA进行多重聚合酶链扩增反应,并将产物应用于位点特异性单碱基延伸反应。最终产物进行脱盐和转移到一个384元素SpectroCHIP阵列。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱完成基因检测,利用MassARRAY系统Typer软件完成质谱图分析。随机抽取的10%的样本重复分析进行质量控制。3、统计学分析第一阶段、第二阶段试验所有对照人群所有SNP位点都进行哈迪-温伯格平衡(HWE)检验。排除不符合HWE检验的SNP位点(P<0.001)。病例组和对照组基因型及等位基因频率计算应用X 2检验或2 × 3、2 × 2表计算。Cochran-Armitage趋势检验用于分类变数数据分析。因为痛风的发生与年龄、体重指数相关,因此年龄、体重指数作为协变量。应用PLINK软件评价候选基因SNP与痛风的相关性。OR值,95%可信区间和P值用于检测不同基因型和疾病的相关性。第一阶段和第二阶段所有重要的关联计算使用最大(T)排列程序校正(100000排列)。应用Haploview程序进行单倍型重构和单倍型为基础的相关计算。使用默认参数推断个体单倍型及其估计的群体频率,并使用排列程序(100000个排列)对多个测试的P值进行校正。单因素方差分析或者Kruskal-Wallis检验进行基因型对各种临床指标的影响。阈值P值设置为0.05,P<0.05被认为是有意义的。应用Haploview软件进行连锁不平衡(LD)分析。方块应用自定义模式:0.7<LD<0.95表示有连锁关系,LD>0.9表示强连锁关系。排除频率<0.05的SNP标记位点。本研究我们应用基因功效计算系统(http://pngu.mgh.harvard.edu/～purcell/gpc/qtlassoc.html)及遗传模型评估统计学效力。遗传模型根据中国人群中痛风的患病率1.14%计算得到22%的风险等位基因频率(约等于本研究中rs2298999次要等位基因频率)。研究Ⅱ:1、研究对象及实验方法急性期患者30例,急性痛风期诊断标准参考2015年美国风湿病学会(ACR)和欧洲风湿病联合会(EULAR)对痛风分类标准建议。慢性期30例,慢性痛风诊断依据痛风临床表现及症状。对照组选择41例健康男性,排除痛风及风湿免疫性疾病。取受检者空腹静脉血5ml,采用酶联免疫吸附试验(EL1SA)检测血清EGF含量。应用不同浓度的单钠尿酸盐(MSU)刺激THP-1细胞系,刺激4h、12h、24 h、48h后,收集细胞培养液上清EL1SA检测EGF浓度;提取细胞内RNA,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行EGF RNA水平的检测。应用100ug/ml MSU刺激THP-1细胞系24小时后,收集细胞培养液上清EL1SA方法检测IL-1β的表达量;提取细胞内蛋白,Western blot方法进行pro-IL-1β的含量检测。细胞培养液中分别加入不同浓度EGF作用2小时,收集细胞培养液上清EL1SA方法检测IL-1β的含量;提取细胞内蛋白,Western blot方法进行pro-IL-1β的含量检测。2、统计学方法所有统计分析均采用SPSS软件进行,图形生成使用Prism软件。多组比较采用单因素方差分析,两组间的差异采用t检验。所有数据应用均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。结果研究Ⅰ:1、候选基因的选择利用pubmed数据库及人类单体型图(hapMap)数据库中已有的中国北京和日本东京正常人群基因分型数据,选择染色体4q25区域周围8个候选基因作为靶基因。其中3个基因与免疫/炎症代谢通路有关:表皮生长因子(EGF)、淋巴增强子结合因子1(LEE1)寡糖基转移酶复合体亚基(OSTC)。其余5个基因与糖脂代谢通路有关:细胞色素P450家族,2家族,U亚家族,多肽1(CYP2U1);超长链脂肪酸延伸酶6(ELOVL6)；磷脂酶A2,组12(PLA2G12A);鞘磷脂合酶2(SGMS2);羟酰基辅酶A脱氢酶(HADH)。2、SNP的选择及基因分型结果依据方法中的SNP挑选原则,第一阶段我们在8个候选基因上共挑选了 96个tag SNPs位点。一阶段样本480例男性痛风患者和480例正常男性对照基因型数据均通过PLINK默认阈值。排除应答率<90%及不符合HWE平衡(PHWE<0.001)的SNP位点。96个SNPs位点中,有91个位点通过最初的质量控制(QC)的标准。多重校正后,ELOVL6基因上rs12504538 SNP与原发性痛风显著相关(Padjusted = 0.00595)。第二阶段,拟在Elov16区域进行精细定位研究。通过数据库发现,Elov16基因上游为EGF基因,下游为假基因,因此选择Elov16基因和EGF基因进行进一步研究。应用飞行质谱法,对Elov16基因及EGF基因上93个标记的SNPs进行基因型分析。91个SNPs位点符合标准(应答率>90%,次要等位基因频率(MAF)>0.05,PHWE>0.001)。功效分析显示,加法模型中,相对危险度1.4-1.6(杂合子和纯合子)检测效力超过80%。EGfrs2298999 T等位基因与中国汉族男性原发性痛风显著相关[比值比(OR)=0.77,95%可信区间(CI)=0.67-0.88,Padjusted=6.42 ×10-3)]。使用Cochran-Armitage趋势检验统计分析显示类似的结果。其他SNPs位位点痛风组和对照组等位基因频率分布无统计学差异。3、连锁不平衡分析和单倍型关联分析LD分析用于检测EGF因单倍型与痛风的关联性。rs2298999与其他7个SNPs位于一个连锁格中(rs11569057,rs2237054,rs11569090,rs10857004,rs10010695,rs6533485 and rs11569126)。8个SNPs组成6种高频率单倍型(H1-H6),对照组中频率分别为0.281,0.157,0.157,0.12,0.114和0.057。在本研究中,危险单倍型H1(包括rs2298999C等位基因)是频率最高的单倍型(痛风组32.4%,对照组28.1%),H1单倍型与痛风显著相关(Padjusted= 0.027)。其他的三种单倍型(H2,H4和H5)也包括rs2298999C等位基因,痛风组和对照组H2,H4和H5单倍型分布频率在两组中分布无差异。4、SNP rs2298999生物信息学分析UCSC数据库ENCODE数据分析显示,SNP rs2298999和其他11个SNPs位于(组蛋白H3乙酰化赖氨酸27)H3K27ac,H3K27ac是活性增强剂的标志物,提示rs2298999位于一个功能区域。GTex数据分析显示,在所有的表达数量性状基因座分析(eQTL)组织中SNP rs2298999均没有显著表达数量性状位点。5、SNP rs2298999基因型和痛风临床特征相关性分析EGF基因SNP rs2298999基因型和痛风临床特征相关性分析显示:TT基因型痛风患者平均病程4.72年,CT基因型痛风患者平均病程5.12年,CC基因型痛风患者平均病程6.38年。通过Kruskal-Wallis检验,SNPrs2298999基因型与痛风病程显著相关(P=0.023)。研究Ⅱ:应用ELISA方法检测痛风患者及对照者血清中EGF水平。与正常对照组相比,痛风急性期患者血清EGF浓度明显降低(20.99±11.80 vs.30.60±11.16,P=0.032)。应用不同浓度MSU刺激THP-1细胞不同时间后,RT-PCR结果显示:与空白对照组相比,100ug/ml浓度MSU刺激24小时EGF RNA水平具有统计学差异(P<0.05)。ELISA结果显示:100ug/ml浓度MSU刺激24小时与空白对照组相比EGF蛋白水平具有统计学差异(P<0.05)。100ug/ml MSU刺激后24小时后,ELISA结果显示IL-1β的表达量明显增加,Western blot结果显示pro-IL-1β的表达量明显增加。进一步加入EGFlOng/ml,可以显著减少IL-1β的表达(P<0.05)及显著减少pro-IL-1β的表达。结论我们发现了位于4q25区域的EGF是痛风的一个新的易感基因。血清EGF水平与急性痛风密切相关。在MSU介导的痛风细胞模型中,EGF通过抑制IL-1β和pro-IL-1β蛋白水平发挥抗炎作用。这些发现增加了目前对痛风易感基因的理解,提示EGF可作为治疗痛风性关节炎的潜在治疗靶点。