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研究背景与目的子宫内膜癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,近年来其发病率呈上升趋势,严重威胁女性健康。无孕激素拮抗的高雌激素长期刺激可增加患病风险。研究发现,雌激素除通过传统的“基因转录效应”发挥作用,还有“非基因转录效应”。研究表明,雌激素可激活子宫内膜癌细胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路,发挥“非核效应”促进癌细胞生长,而GPER是介导“非基因转录效应”最可能的候选分子。我们前期研究提示,子宫内膜癌中雌激素对PI3K/AKT信号通路活化极有可能是由G蛋白偶联雌激素受体(GPER)介导。百日咳毒素(Pertussis toxin, PTX)是百日咳杆菌产生的一种毒力蛋白,抑制G蛋白介导的相关通路。国内外关于PTX阻断GPER及其介导的AKT信号通路的研究,报道极少,本实验通过建立裸鼠子宫内膜癌移植瘤模型,观察G蛋白偶联受体抑制剂百日咳毒素(PTX)对子宫内膜癌移植瘤的细胞凋亡及对磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号传导通路中磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)表达的影响,探讨通过阻断GPER及其介导的PI3K/AKT信号通路来治疗子宫内膜癌的可能性。方法1.静置贴壁法体外培养人子宫内膜癌HEC-1A、Ishikawa细胞系。2.建立裸鼠子宫内膜癌移植瘤模型以及实验分组和给药,无特定病原体(specific-pathogen free, SPF)级环境下饲养裸鼠,裸鼠购回后适应性生长3天,取对数生长期的HEC-1A、Ishikawa细胞,收集后制成1.2×107/mL的细胞悬液,无菌条件下接种于裸鼠右背部皮下,0.2ml/只(约含2.4x106个细胞),接种瘤细胞后将裸鼠在原条件下饲养,每天观察其精神、活动、饮食、排便等状况。细胞接种7天后,可见裸鼠背部结节状肿瘤生长,以最长径达5mm为成瘤阳性标准,将HEC-1A、Ishikawa细胞接种后成瘤阳性的裸鼠分为4组:HEC-1A对照组、HEC-1A实验组、Ishikawa对照组、Ishikawa实验组,每组7只,实验组腹腔注射PTX(250ng/只),每周2次,共4周,对照组腹腔注射同体积生理盐水建立裸鼠子宫内膜癌移植瘤模型、测量裸鼠体重及瘤体大小。3.HE染色光学显微镜下观察移植瘤组织的病理学特点,原位末端标记法(TUNEL)检测移植瘤组织中凋亡细胞,计算凋亡指数(AI),比较实验组与对照组的凋亡情况。4.免疫组织化学SP法观察阳性细胞数和染色强度并记分进行半定量分析检测p-AKT的表达情况。5.统计学方法,采用SPSS17.0软件分析,方差齐性检验、t检验、等级资料秩和检验等,a=0.05为检验水准,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.PTX均能有效抑制HEC-1A、Ishikawa细胞裸鼠移植瘤生长,抑瘤率分别为38.74%、33.21%。2.HE染色显示,与对照组相比实验组细胞异型性、核浆比相对较小;TUNEL检测可见实验组细胞凋亡比率较对照组明显提高(Ishikawa,t=10.69,p<0.05;HEC-1A,t=—11.16,p<0.05)。3.免疫组织化学结果显示,p-AKT主要在胞浆表达,对照组肿瘤组织中表达较高,黄色颗粒着色较深,呈棕褐色,且阳性细胞数较多。用药组棕黄色颗粒染色较对照组明显减弱、变浅,阳性细胞数少,提示p-AKT表达降低:四组均无阴性表达,HEC-1A对照组(+)1例、(++)2例,(+++)4例,实验组(+)5例,(++)、(+++)各1例;Ishikawa对照组(+)1例、(++)(+++)各3例,实验组(+)5例,(++)、(+++)各1例,采用等级资料的秩和检验,HEC-1A实验组与对照组比较差异有统计学意义(X2=9.50,P<0.05),Ishikawa实验组与对照组比较差异无统计学意义(X2=10.50,P>0.05)。结论PTX通过抑制GPER及其介导的PI3K/AKT通路,抑制子宫内膜癌裸鼠移植瘤的生长,促进其凋亡。