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采用磁珠富集法构建鲤鱼(Cyprinus carpio)三、四核苷酸重复微卫星序列,设计并筛选出能够在鲤鱼基因组稳定扩增和具有多态性的多个微卫星标记。利用这些微卫星标记,以在表型性状上具有明显差异的荷包红鲤(Cyprinus carpio var.wananensis)抗寒品系和柏氏鲤(Cyprinus pellegnini pellegnini Tchang)的F2为作图群体,构建鲤鱼遗传连锁图谱并对乳酸脱氢酶(LDH)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性性状进行了QTL检测。研究的主要结果如下:
1.鲤鱼三、四核苷酸微卫星引物的开发
采用磁珠富集法和放射性杂交相结合建鲤鱼(Cyprinus carpio)三、四核苷酸重复微卫星序列,设计并合成微卫星引物145对,筛选出112对具有多态性和稳定扩增的微卫星引物。
2.遗传连锁图谱的构建
利用Onemap软件对筛选出的202个多态性标记进行连锁分析,构建出一个鲤鱼连锁图谱。鲤鱼连锁图谱有104个标记(66个SSR,38个EST-SSR)定位到35个连锁群上,其余98个标记没有定位到连锁群上。该图谱总长度为869.8cM,标记间平均距离为12.61cM。每个连锁群含2~13个标记,连锁群长度为0.6cM~151.8cM,各连锁群平均图距为0.55cM~30.1cM。
3.鲤鱼乳酸脱氢酶(LDH)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性性状进行了QTL检测
通过多态性微卫星标记与乳酸脱氢酶(LDH)活性和超氧化物歧化酶(SOD)活性性状QTL检测,结果表明:HLJE222等12个座位与乳酸脱氢酶(LDH)活性性状显著相关(P<0.05),可解释的表型变异型为4.00%~10.00%,其中HUE222座位与该性状极显著相关(P<0.01),可解释的表型变异型为10.00%;HLJE599和HLJ1496这2个座位与超氧化物歧化酶(SOD)活性性状显著相关(P<0.05),可解释的表型变异型为4.00%~6.00%,说明这两个座位可能与影响超氧化物歧化酶(SOD)活性相关的基因连锁。
4.检测结果分析
利用已有的生物信息学工具,将相关的EST-SSR标记与公共数据库中的核酸序列以及已知蛋白序列进行同源搜索分析,结果发现与鲤鱼乳酸脱氢酶活性极显著相关的EST(HLJE222),与斑马鱼DAZassociatedprotein1,mRNA相匹配,DAZ蛋白是一种短链的脱氢酶,是生物体细胞内糖代谢过程的重要酶。这说明此基因座与控制乳酸脱氢酶活性相关的基因连锁,进一步证明本研究结果的可信度。
尽管本研究构建鲤鱼的遗传图谱标记数量有限,但是随着图谱密度的增加和QTL定位,使目的基因的定位成为可能,为实现分子标记辅助育种迈进了很重要的一步。