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一研究目的雌激素(estrogen, E)是人体内关键的调节激素,与雌激素受体(estrogen receptor,ER)结合后发挥生物学效应,这点对于女性来说更为重要。妇女绝经后易高发卵巢癌、子宫内膜癌、骨质疏松、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化等疾病是因为绝经后雌激素水平显著降低引发的。虽然目前采用雌激素替代疗法(estrogen replacement therapy, ERT)可缓解症状,但是副作用也不容小视。此时从天然植物中提取,无明显副作用的植物雌激素(phytoestrogen, PE)进入人们的研究视野。许多治疗妇科疾病的中药如川红花、牛膝、补骨脂等均含有植物雌激素成分。植物雌激素与内源性雌激素结构类似,同样是与体内相应的ER结合发挥作用,具有雌激素和抗雌激素双重效应。一方面,当体内雌激素水平较低时,PE与ER结合发挥微弱的雌激素样作用,并启动一系列生理反应；另一方面,体内雌激素水平较高时,PE又可竞争性地抑制内源性雌激素发挥作用而产生抗雌激素作用。羟基红花黄色素A (hydroxysafflor yellow A, HSYA)是中药红花中生物活性最强的药理成分,发挥作用的过程与内源性雌激素类似,其所具有的雌激素受体亚型特异性结合与调节功能的相关研究尚未见报道。本研究拟从细胞与分子水平着手,阐明HSYA的植物雌激素样作用及发挥作用的物质基础和作用机制,以期为红花相关中成药及制剂的临床应用提供理论依据。二研究方法和结果1HSYA对T47D细胞和SK-BR-3细胞增殖、细胞周期的影响1.1以ER阳性人乳腺癌T47D细胞为研究载体,以HSYA为研究对象,通过MTT方法检测细胞增殖情况,通过流式细胞术检测细胞周期变化。1.1.1检测不同浓度HSYA对T47D细胞增殖的影响结果：应用MTT去进行细胞增殖试验,与正常对照组相比,HSYA在24h即表现出促细胞增殖作用,在48h时最显著,至72h时作用减弱。1.1.2检测ER完全拮抗剂、ERa拮抗剂、ERβ拮抗剂、ERa激动剂、ERp激动剂干预下T47D细胞增殖变化结果：HSYA对T47D细胞增殖的促进作用,可被雌激素受体完全拮抗剂所拮抗。加入ERa拮抗剂MPP与ERβ拮抗剂PHTPP后拮抗了雌二醇及HSYA促细胞增殖的作用。并且相同剂量的PHTPP比MPP的作用更明显,提示ERβ表达量的变化对细胞增殖的影响比ERa更显著。与正常对照组相比,雌二醇组及雌二醇分别加入ERa激动剂PPT、ERβ激动剂DPN组,促进细胞增殖作用显著。在HSYA加入ERa激动剂PPT、ERβ激动剂DPN后,其对于HSYA原有的促增殖作用无太大影响。但与10"7mol-L-1HSYA相比,加入PPT72h时具有显著促进作用。1.1.3检测HSYA对T47D细胞周期的影响结果：选取药物作用效果显著的48h检测细胞周期,发现10-6mmo1·L-1、10-7mo1·L-1的HSYA使细胞S期比例增加,G2/M期的比例也有小幅上升,使细胞增殖指数升高。1.2以ER阴性人乳腺癌SK-BR-3细胞为研究载体,以HSYA为研究对象,通过MTT方法检测细胞增殖情况。结果：10-5mol·L-1-10"7mol·L-1的HSYA对SK-BR-3细胞有抑制作用,并且该作用一直持续48h.10-9mol·L-1的HSYA对细胞有轻微的促进增殖作用。48h时各组与正常对照组相比均无显著性差异。2HSYA对T47D细胞ERmRNA表达的影响采用实时荧光定量RT-PCR技术,从基因水平探讨HSYA发挥植物雌激素样作用的机制。结果：HSYA显著促进ERα、ERPmRNA的表达。药物作用组ERβmRNA/ERamRNA比值显著高于正常组。3HSYA对T47D细胞和SK-BR-3细胞雌激素效应蛋白表达的影响3.1以T47D细胞为载体,应用Western blot方法观察HSYA对ERα、ERβ、ERK1/2、 p-ERK1/2、P27、PR六种蛋白表达的影响,从蛋白水平探讨HSYA发挥植物雌激素样作用的机制。结果：10-7mol·L-1的HSYA促进ERa表达达最大值,且呈现一定剂量依赖性。10-7mol·L-1、10-8mol·L-1的HSYA促ERp表达的作用最明显。ERp与ERa的比值随HSYA浓度的变化而变化,与细胞增殖相关,在10"7mol·L-1、10-8mol·L-1HSYA作用下,ERβ/ERa值最大,促细胞增殖作用也应最显著。10-7mol·L-1的HSYA显著促进ERK1/2及p-ERK1/2的表达。HSYA作用下P27蛋白的表达均显著低于正常组。10"7mol·L-1、10-8mol·L-1的HSYA显著促进PR蛋白表达,但10-9mol·L-1抑制了PR蛋白表达。3.2以SK-BR-3细胞为载体,应用Western blot方法观察HSYA对ERK1/2、p-ERK1/2两种蛋白表达的影响。结果：10’7mol·L-10-9mol·L-1的HSYA显著抑制了ERK1/2的表达,且呈一定剂量效应关系。但HSYA对p-ERK1/2蛋白的表达影响不明显。4进行雌激素受体质粒转染,构建ER阳性细胞模型。将ERα、ERβ质粒DNA通过脂质体转染到HEK293田胞中,并进行翻译。结果：通过VVestern blot验证质粒成功转染到细胞中并表达。