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乙肝病毒X蛋白对肝细胞凋亡的影响新型抗乙肝病毒化合物的筛选乙肝病毒X蛋白(HBV X protein, HBx)与乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)相关肝癌(HCC)的发生和发展密切相关。深入研究HBx在HCC形成中的作用将为探索HBV致癌机制提供重要依据。HBx为多功能蛋白,能够调节细胞内多条信号传导途径,从而调控许多细胞基因的转录；HBx还可以调节细胞增殖与凋亡,促进肝癌细胞的侵袭和转移。许多文献表明HBx既具有促进细胞凋亡又具有抑制细胞凋亡的功能,原因还不清楚。在本研究中,我们发现HBx对Huh7肝细胞凋亡的影响存在剂量依赖性,在低剂量转染HBx表达质粒时,HBx抑制细胞凋亡,而当HBx表达质粒的转染量达到较高水平时,HBx反而会促进细胞凋亡。近期Clippinger等发现在同一细胞株中HBx即可以促进细胞凋亡又可以抑制细胞凋亡,决定因素在于NF-kB的活性状态。我们的研究初步发现HBx随着表达量的不同可以影响NF-κB的细胞定位。全球约有3亿5千万人被HBV慢性感染,其中10-15%的慢性肝炎忠者最终可能发展为肝硬化或肝细胞癌。目前慢性乙肝的治疗药物主要有两大类,核苷(酸)类似物和干扰素。现有药物存在的主要问题是核苷(酸)类似物长期使用会诱导病毒耐药株的出现；而干扰素应答率低且副作用大,因此迫切需要研发新型抗HBV药物。金丝桃(Hypericum chinense L.)是金丝桃科金丝桃属植物。文献研究曾发现金丝桃具有抗菌抗病毒的活性。本部分中,我们与复旦大学药学院穆青课题组合作,在细胞水平上对金丝桃的各种分离提取物进行了细胞毒性分析和抗HBV活性分析,初步筛选出了单体HCF2-4-2-5,其对HBV DNA复制、HBsAg和HBeAg蛋白的表达水平均有一定的抑制作用,为进一步研究提供了先导化合物。第一部分HBx蛋白对Huh7肝细胞凋亡的影响目的验证HBx蛋白的不同表达剂量对Huh7肝细胞的凋亡是否存在不同的影响。方法构建HBx表达质粒,通过脂质体转染的方法将不同量的HBx表达质粒分别转染入Huh7肝细胞和293T细胞中,转染48h后进行凋亡相关的检测,包括FITC-Annexin V流式细胞检测,Caspase 3蛋白酶的降解体的检测,线粒体及胞浆内Cytochrome C的检测等,以确定细胞凋亡的变化情况与HBx的表达量是否存在规律性的关联。通过免疫荧光共聚焦方法对HBx和NF-kB的细胞内定位进行了初步探索。结果HBx的不同表达量可对细胞凋亡产生不同的影响。对于1×106个细胞,在转染较低量的HBx表达质粒(0.25μg、0.5μg)时,可以一定程度的抑制凋亡作用；而当HBx表达质粒的转染量提高到1μg以上时,细胞凋亡反而愈发明显。进一步研究发现不同量的HBx在细胞内的定位不同,而NF-kB随之在细胞内的定位也不同,为研究不同剂量HBx对细胞凋亡的影响机制提供了初步的线索。结论HBx在低表达量时可以抑制细胞凋亡,而高表达量时反而促进细胞凋亡。第二部分新型抗HBV化合物的筛选目的从金丝桃植物中提取分离一系列粗产物及化合物单体进行抗HBV活性的筛选,以期获得具有抗HBV活性的先导化合物。方法培养HBV稳定复制的肝癌细胞(HepG2.2.15),将不同稀释度的化合物分别加入培养基中,4天后通过CCK-8法检测药物的细胞毒性,确定合适(存活率90%以上)的用药浓度。抗病毒活性筛选中,加药4天后分别用ELISA法检测细胞培养基中HBsAg、HBeAg表达量及应用Real-time PCR法检测上清中及胞内HBV DNA的含量。结果从金丝桃中提取的单体化合物HCF2-4-2-5可明显减少HepG2.2.15细胞上清中的HBV DNA含量。结论HCF2-4-2-5具有一定的抗HBV活性,为在此基础上进一步优化奠定了基础。