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目的:本课题研究目的主要是检测套细胞淋巴瘤(Mantlecelllymphoma,MCL)组织中BTK蛋白的表达水平,并阐明其与患者临床特征及预后的相关性;然后探讨新一代BTK抑制剂BGB-3111单药和联合硼替佐米(bortezomib,BTZ)后对MCL细胞的细胞毒性作用以及诱导凋亡机制的初步研究。期望为新一代BTK抑制剂BGB-3111在MCL患者临床治疗上拓展治疗方案,提高MCL患者的临床预后。方法1、采用免疫组织化学染色法检测32例MCL患者肿瘤组织中BTK的表达水平,并收集患者的临床病例资料。2、采用SPSS17.0统计学软件分析BTK表达水平与患者临床特征、无进展生存期(progressionfreesurvival,PFS)和总生存(overallsurvival,OS)的相关性。3、细胞学实验中,选用5株MCL细胞系,分别检测其BTK总蛋白的表达水平,根据蛋白WB结果选出3株BTK高表达的MCL细胞系。采用MTS法分别检测BGB-3111、硼替佐米单药对这3株MCL细胞增殖的影响。4、BGB-3111单药处理的MCL细胞经PI染色后,采用流式细胞仪检测BGB-3111单药对MCL细胞周期的影响。5、采用流式细胞仪检测BGB-3111单药处理MCL细胞后经AnnexinV/PI染色,BGB-3111单药对MCL细胞凋亡的影响。6、采用Westernblotting分析BGB-3111和依鲁替尼分别对ITK总蛋白表达的影响。7、采用MTS法检测BGB-3111联合硼替佐米对MCL细胞增殖的影响,并用CompuSyn软件分析两药是否具有协同效应。8、采用流式细胞仪检测BGB-3111联合硼替佐米对MCL细胞凋亡的影响。9、采用Westernblotting分析BGB-3111联合硼替佐米后,对MCL细胞凋亡相关蛋白表达的影响。10、采用Westernblotting分析BGB-3111联合硼替佐米后,对MCL细胞NF-κB信号通路的调控作用。结果:1、免疫组化染色结果显示,BTK蛋白在MCL组织和良性反应性增生淋巴组织中均呈阳性表达;但在良性反应性增生淋巴组织中,BTK呈弱阳性表达并只局限在生发中心外套区;而在MCL组织中呈强阳性表达,其强阳性表达率高达59.4%(19/32)。2、BTK的表达与患者临床特征(性别、年龄、临床分期、骨髓受累、B症状、MIPI评分等)之间的相关性分析显示,BTK的阳性表达与Ki-67和MIPI评分相关,在Ki-67≥30%(χ2=5.783,P=0.019)和MIPI评分≥6分时(χ2=4.522,P=0.038),BTK呈强阳性表达。3、Kaplan-Meier预后相关性分析结果显示,BTK强阳性表达的患者PFS较差,且差异具有统计学意义(P<0.05);但其强阳性表达患者的OS并无显著统计学差异(P=0.073),随访时间有待进一步延长并继续观察。4、PFS的单因素分析结果显示,年龄≥65岁(χ2=11.348,P=0.001)、ECOG评分≥2分(χ2=15.57,P<0.001)、骨髓受累(χ2=4.138,P=0.042)、BTK强阳性表达(χ2=4.699,P=0.03)、Ki-67≥30%(χ2=4.823,P=0.028)、MIPI评分≥6分(χ2=25.543,P<0.001)皆是MCL患者的不良预后因素。但由于样本量的限制,在Cox模型多因素分析结果中只发现MIPI评分≥6分是独立的不良预后因素,BTK的强阳性表达尚不能作为MCL患者的独立预后因素。5、细胞增殖实验结果显示,BGB-3111和硼替佐米单药作用Jeko-1、Rec-1、Z138细胞均可抑制细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性;两药分别以2/5IC50~5/5IC50浓度联合后,其联合指数CI均<1,显示较低浓度的两药联合对MCL细胞的增殖抑制作用具有协同效应。6、细胞周期实验结果显示,BGB-3111单药作用MCL细胞48h后,可剂量依赖性诱导MCL细胞阻滞在G0/G1期,1uMBGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后,G0/G1期百分比为27.02%~40.14%;2uMBGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后,G0/G1期百分比为33.44%~46.82%;3uMBGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后,G0/G1期百分比为42.97%~59.04%。7、细胞凋亡实验结果显示,BGB-3111单药作用MCL细胞48h后可诱导细胞凋亡,并呈剂量依赖性;3uMBGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后,细胞凋亡率为7.4%~22.4%,6uMBGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后,细胞凋亡率为15.4%~37.2%,9uMBGB-3111单药作用3株MCL细胞48h后,细胞凋亡率为30%~59.1%;低浓度即2/5IC50BGB-3111联合2/5IC50BTZ作用MCL细胞48h后,联合治疗组凋亡率较单药治疗组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。8、Westernblotting检测结果显示,Ibrutinib可降低ITK总蛋白的表达,而BGB-3111对ITK缺乏选择性。9、Westernblotting检测结果显示,BGB-3111可抑制PARP总蛋白表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,同时促进了cleavedcaspase-9蛋白表达,提示其对应蛋白裂解增加,从而诱导细胞凋亡;联合BTZ后,增强其作用。10、Westernblotting检测结果显示,BGB-3111发挥以上功能可能是通过下调MCL细胞BTK蛋白的磷酸化,进一步抑制IKBa和P65的磷酸化,影响NF-κB核转录来实现的。联合BTZ后,增强其作用。结论:1、BTK蛋白在MCL组织中呈强阳性表达,且强阳性表达患者与Ki-67和MIPI评分显著相关。2、BTK强阳性表达的患者与弱阳性表达患者相比PFS明显缩短(P=0.03),而OS确无统计学差异,有待进一步延长随访时间。3、PFS预后单因素分析显示,BTK强阳性表达是影响MCL患者的不良预后因素(P=0.03),但多因素分析显示,在本研究有限的样本中观察到BTK强阳性表达尚不能作为MCL患者的独立预后因素。4、BGB-3111可抑制MCL细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性;较低浓度联合BTZ,可协同增强抑制MCL增殖。5、BGB-3111可诱导MCL细胞阻滞在G0/G1期。6、BGB-3111相比Ibrutinib对ITK分子缺乏选择性,相对于BTK具有更高的特异性,具有更好的限制性脱靶活性7、BGB-3111可促进MCL细胞凋亡;较低浓度联合BTZ,可协同诱导细胞凋亡。8、BGB-3111可抑制MCL细胞PARP总蛋白,下调Bcl-2表达,同时促进cleavedPARP和cleavedcaspase-9蛋白表达;联合BTZ,可协调增强其作用。9、BGB-3111诱导以上功能变化是通过下调BTK活性、抑制IKBa和P65的磷酸化,进而调控NF-κB活性来实现的;联合BTZ,可协调增强其调控作用。