脑卒中是威胁人类生命健康的主要疾病之一,约80%属于缺血性脑卒中,具有高发病率、高死亡率和高致残率的特点。由于其狭窄的治疗时间窗及严重的副作用,迄今为止,大部分脑卒中患者仍不能接受到安全有效的治疗。小续命汤是治疗脑卒中的经典中药方剂,首载于《备急千金要方》(唐朝,孙思邈),由12味中药组成,成分复杂,疗效显著,已有上千年的临床应用历史。该复方为口服用药,进入胃肠道后可被多种生物膜选择性吸收进入血液并随体循环分布于靶器官,达到有效量后发挥药效。此外,有研究表明心血管疾病往往伴随着肠道菌群紊乱的现象,而肠道菌群紊乱可导致宿主体内糖类和脂质等物质代谢失调,并加强体内炎症反应和氧化应激,促使疾病发生或恶化。肠道菌群作为人体代谢和免疫调节等过程的重要参与者,研究其与心血管疾病的相互关系对治疗心血管疾病具有重要意义。综上,本课题首先对急性脑缺血再灌注模型大鼠血浆和脑组织中的小续命汤有效成分进行研究;进而利用Illumina MiSeq高通量测序技术对急性脑缺血再灌注模型大鼠模型粪便细菌16S rDNA基因的V3-V4区进行全面分析,探索急性脑缺血再灌注大鼠肠道菌群的结构特征和小续命汤对脑缺血再灌注大鼠肠道菌群的调节作用,从而揭示小续命汤通过调节肠道菌群稳态而间接治疗缺血性脑卒中的作用机制;最后利用蛋白质组学技术探索小续命汤有效成分组直接作用于脑组织的生物学靶点。具体研究内容如下:1.小续命汤有效成分组在急性脑缺血再灌注大鼠体内的化学成分研究。利用栓线法建立大鼠大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,并给予小续命汤进行预防性治疗,缺血1.5h,再灌注24h后,利用Zea-Longa’s行为学评分法和脑组织TTC染色法对小续命汤的脑保护作用进行评估。之后通过UPLC-HRMS技术对大鼠血浆及大脑皮层中的小续命汤有效成分进行快速分析和鉴定。结果显示,MCAO大鼠(XXMD治疗组)和正常大鼠(XXMD干预组)的血浆中共鉴定出29个化合物,主要包括黄酮类、生物碱类、色原酮类和萜类和氰苷类化合物,在XXMD治疗组和XXMD干预组中分别鉴定到27个和23个化合物。其中苦杏仁苷和防己诺林碱只在XXMD干预组大鼠的血浆中被检测到,而新乌头碱、5,7-二氧甲基-4’,6-二羟基黄酮、5,7-二甲氧基-4’,6-二羟基黄酮糖醛酸苷、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和人参皂苷Rc则只在XXMD治疗组大鼠血浆中被检测到。同时,在两组大鼠的大脑皮层中共鉴定出鉴定出14种化学成分,主要包括黄酮类、生物碱类和萜类化合物。XXMD干预组中只鉴定到其中7个化合物,5-O-甲基维斯阿米醇苷、芍药苷、附子灵、熊果酸、黄芩苷、汉黄芩苷和灯盏花甲素只在XXMD治疗组中被检测到。同时,由于XXMD治疗组大鼠大脑皮层缺血侧组织坏死,血流灌注减少,上述化合物均存在于未缺血侧的皮层中。结果表明小续命汤有效成分组在正常和病理状态下大鼠血浆及大脑皮层中的化学成分存在差异,为疾病状态下的物质体内过程及药理作用的研究提供了 一定的参考。2.小续命汤有效成分组对急性脑缺血再灌注大鼠肠道功能及肠道菌群的影响。利用HE(Hematein-Eosin)染色、透射电镜检测以及血浆中脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)浓度水平观察大鼠回肠组织肠道屏障功能变化并基于Illumina MiSeq高通量测序技术分析大鼠肠道菌群结构特征。结果显示,MCAO模型组大鼠的回肠组织粘膜层水肿及毛细淋巴管扩张严重,上皮细胞、杯状细胞、线粒体结构以及微绒毛均出现严重的病理变化,并且外周血中LPS浓度显著升高。而XXMD治疗组大鼠的回肠组织结构在一定程度上得到恢复,外周血中的LPS浓度显著下降。肠道菌群测序结果显示,与假手术组相比,MCAO模型组大鼠的肠道菌群多样性和丰富度均显著下降,XXMD治疗组大鼠在肠道菌群多样性和丰富度方面则具有显著的回调趋势。进一步对差异性菌群分析发现,MCAO模型组大鼠肠道菌群结构紊乱的主要表现为肠道内肠杆菌等炎症致病菌增加且普雷沃氏菌属等代谢相关有益菌减少,而XXMD治疗组大鼠肠道内菌群结构则表现出相反的变化趋势,对普雷沃氏菌属和埃希氏菌属-志贺氏菌属等菌群的丰度均有回调作用。上述结果表明小续命汤能够缓解由急性脑缺血再灌注引起的肠道屏障功能损伤,并通过增加代谢相关有益菌和减少炎症相关致病菌调节肠道菌群稳态,为小续命汤基于肠道菌群治疗急性脑缺血再灌注大鼠的药理作用奠定了基础。3.小续命汤有效成分组治疗急性脑缺血大鼠的蛋白质组学数据挖掘和初步验证。利用蛋白质组学和Western Blot技术分析大鼠缺血侧大脑皮层总蛋白,探索小续命汤有效成分组对急性脑缺血再灌注大鼠治疗作用的生物学基础。研究结果显示,假手术组和MCAO模型组比较获得522个差异蛋白,MCAO模型组和XXMD治疗组比较获得464个差异蛋白。通过生物学功能分析发现,这些差异蛋白主要参与细胞转化、生物调节、代谢过程等生物过程。对差异蛋白进行Pathway代谢通路注释,发现这些差异蛋白涉及PI3K/Akt信号通路和MAPK信号通路等炎症及凋亡通路;利用Western Blot技术对PI3K/Akt/NF-κB和MAPK信号通路进行验证,结果显示,XXMD治疗组能够显著降低急性脑缺血再灌注大鼠大脑皮层中的p-AKT/AKT、p-NF-κBP65/NF-κBP65和p-JNK的表达水平。上述结果表明小续命汤可能通过抑制PI3K/AkT/NF-κB和MAPK/JNK信号通路发挥其抗炎和抗凋亡等作用。