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红法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous,也称 Phaffia rhodozyma）,是一种呈现橘红至深红色的异担子菌酵母,可天然合成以虾青素为主要成分的类胡萝卜素。天然虾青素是一种叶黄素类酮类胡萝卜素,具有超强抗氧化性能、极强的色素沉积能力和较强的抗炎、抗癌活性,已被广泛用于人类高级保健食品、水产与家禽养殖的饲料添加剂、药品的原料和化妆品添加剂等,但价格居高不下。当前,红法夫酵母已被应用于工业生产天然虾青素,通过诱变获得虾青素高产突变体和优化培养基中的碳源、氮源等,已被证明是提高红发夫酵母虾青素产量的有效策略。然而,关于其虾青素产量提高的分子机制尚不清楚,阻碍了利用代谢工程的方法进一步提高虾青素的产量。此外,由于红发夫酵母具有强劲的内生萜类代谢途径,具有开发成生产类异戊二烯的细胞工厂的巨大潜力。因此,有必要深入研究虾青素生物合成途径的调控机制及其如何与其他细胞代谢过程发生相互作用。在本研究中,作者以X.dendrorhous AS2.1557（WT）为出发菌株或野生型菌株,先后使用亚硝基胍（NTG）、紫外线（UV）、常压室温等离子体（ARTP）进行多轮菌株诱变,并通过“颜色筛选法”从平板上初步筛选出较出发菌株菌落颜色更红的突变株,然后采用超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC）分析上述菌株的虾青素产量,从而鉴定出虾青素产量提高的阳性突变株。经过三轮诱变筛选,共获得了 13个虾青素产量较野生型菌株有不同程度提高的阳性突变株,分别为AS1-3、AS3-2、A1、A19、A26、A27、A29、A30、A31、A32、ARTP-6、ARTP-8 和 ARTP-9。AS1-3 是在 WT 的基础上经NTG诱变获得;AS3-2是在AS1-3的基础上通过UV诱变获得;其他突变子都是在AS3-2的基础上经过ARTP诱变获得。随后,将上述菌株分别接种到含YPD培养基的摇瓶中,连续培养72 h后表征虾青素产量。其中,野生型菌株单位体积虾青素产量为0.26 μg/mL,单位细胞干重的虾青素产量为49.05 μg/g;阳性突变子AS1-3虾青素产量的对应值为0.46 μg/mL和110.53μg/g,分别为野生型的1.76倍和2.24倍;阳性突变子AS3-2虾青素产量的对应值为0.99μg/mL和201.5 μg/g,较AS1-3的分别提高了 1.15倍和0.83倍,是野生型的3.80倍和4.1倍;阳性突变株A1、A19、A26、A27、A29、A30、A31、A32、ARTP-6、ARTP-8 和 ARTP-9 的虾青素产量处在 1.64～2.67 μg/mL和384.57～701.6 μg/g的范围内,其中阳性突变株ARTP-8的虾青素产量则可达到2.21μg/mL和701.69 μg/g,较AS3-2的分别提高了 1.21倍和2.48倍,是野生型的8.5倍和14.3倍;虾青素产量最高的菌株为A1,分别为2.67 μg/mL和407.34 μg/g,较AS3-2的分别提高了 1.67倍和1.02倍,是野生型的10.2倍和8.3倍。与此同时,为探究培养基成分对虾青素积累的影响,在获得虾青素产量明显提高的突变菌株AS3-2后,本论文随即对该菌株在四种不同培养基（即YPD、YM、YPM和YCS）中培养后的虾青素产量进行比较研究,分析菌株分别在培养48、72、96、120和144 h后的菌体密度和虾青素产量,结果显示在培养基YCS中培养96 h后产量最高,达到了 3.30μg/mL和604 μg/g,是YPD培养基的3.6倍和3.26倍;在培养基YM、YPM和YCS中分别培养72 h后,AS3-2 的虾青素产量分别为 1.22 μg/mL（333.27 μg/g）、1.65 μg/mL（545.51μg/g）和2.56 μg/mL（403.73μg/g）,相较于YPD培养基分别提高了22%（65%）、65%（170.72%）和 165%（100%）。由此可见,培养基 YM、YPM 和 YCS 比 YPD 更有利于AS3-2菌株合成虾青素。为进一步探究诱变、培养基对影响AS3-2菌株虾青素产量的分子机制,本论文随后比较了 WT和AS3-2菌株分别在YPD和YPM中22℃培养48 h时的转录组进行了比较分析。进行转录组测序的样品分别为在YPD培养48 h的WT样品（记为DWT）、在YPD中培养48h的AS3-2样品（D32）、在YPM培养48 h的WT（MWT）和在YPM培养48 h的AS3-2样品（M32）,每个样品设置三个平行。测序结果获得约150 GB测序数据,经基因注释显示有6783个基因,新基因有403个。差异表达分析显示:DWTvsD32有695个基因差异表达,上调的为259个;MWT vs M32有727个基因差异表达,上调的为483个;DWT vs MWT有2439个基因差异表达,上调的为1163个;D32vsM32有2315个基因差异表达,上调的为1236个;DWTvs M32有2522个基因差异表达,上调的为1280个。进一步利用GO和KEGG等数据库对差异表达基因进行功能注释与通路富集,分析结果表明突变引起的基因表达差异数量较少,培养基差异引起的基因表达差异数量较大,结合实际数据发现突变引起的表达差异主要集中在糖酵解、丙酮酸代谢、过氧化物酶体上,而培养基差异不仅能够引起糖酵解、过氧化物酶体、丙酮酸代谢等基因的表达差异,也能够明显的影响甾醇的合成、脂肪酸降解等。对虾青素合成途径中的几个关键基因的转录本进行分析,了解可变剪切对于虾青素积累的作用。结果发现牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（CrtE）和八氢番茄红素-β-胡萝卜素合酶（CrtYB）都有2个转录本,其中1个为新转录本;八氢番茄红素脱氢酶（CrtI）有3个转录本,2个为新转录本;虾青素合酶（CrtS）测序显示有两个同工酶基因,3个转录本,1个为新转录本。在类胡萝卜素合成途径中crtE、crtI和crtS基因表达量相较于野生型在YPD培养基（DWT）组别都有所提高,同时crtYB基因表达量下调。以上比较转录组学分析表明,虾青素产量的提高不仅需要设计到其合成通路上的关键基因,还与糖酵解、甾醇合成、脂肪酸降解、丙酮酸代谢等代谢活动有关。糖酵解中关键基因己糖激酶和丙酮酸激酶拷贝数的增加有利于乙酰CoA和NADH的合成,为后续虾青素合成提供更多的前体物质;在丙酮酸代谢的通路中,乙酰CoA羧化酶基因、同柠檬酸合酶基因和苹果酸脱氢酶基因拷贝数下降,同时乙酰CoA酰基转移酶基因拷贝数增加,有利于乙酰CoA流向萜类骨架合成途径;甾醇合成途径的限速酶——角鲨烯环氧酶基因的拷贝数下降,同时萜类骨架合成途径中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸酯合酶拷贝数增加,使得更多的FPP流向类胡萝卜素合成途径,有利于虾青素的合成。由上可知,本研究不仅获得了虾青素产量显著提高的红法夫酵母诱变菌株,也鉴定了有利于虾青素合成的培养基,并揭示了菌株诱变实验和培养基优化实验中红法夫酵母调控合成虾青素的分子机制,为研究采用代谢工程策略来提高红法夫酵母的虾青素产量提供了依据。