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背景与目的：沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, Ct)是一种严格胞内寄生的革兰阴性菌，是世界范围内引起性传播感染的主要病原体之一。Ct生殖道感染通常呈慢性或无症状，容易形成上行性感染，导致严重并发症，例如附睾炎、前列腺炎、子宫内膜炎、输卵管炎、异位妊娠和不育。深入研究Ct的致病机制、寻找药物干预靶点，将为临床防治Ct感染提供重要的实验及理论依据。由于Ct胞内生存的特性，其在早期需要通过调控宿主相关信号通路、调节宿主细胞基因转录，改变宿主细胞生物学行为从而实现免疫逃避，完成胞内发育周期。本课题组前期发现的Ct唯一一种分泌型质粒蛋白pORF5被证明是Ct必不可少的致病因子，在衣原体感染早期阶段被分泌至宿主细胞胞浆中，参与了衣原体致病过程。长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)为一类重要的基因表达调控元件。本研究以人宫颈癌上皮细胞为模式细胞，构建E型Ct持续性感染模型，在此模型基础上探究宿主在衣原体急性感染和持续性感染过程中差异表达的lncRNA和mRNA及其相关信号传导通路，随后分析pORF5对宿主lncRNA和未折叠蛋白反应(Unfolded protein response, UPR)的影响，进一步确定pORF5在Ct感染过程中的作用。本研究为Ct抵抗宿主细胞凋亡、维持细胞稳态提供了重要依据，为Ct致病机制的研究和潜在干预靶点的筛选提供了新思路。
方法：
1.分别应用不同浓度的人重组干扰素γ(Interferongamma,IFN-γ)和青霉素G处理HeLa细胞后，间接免疫荧光法(Immunofluorescence assay, IFA)检测不同浓度下衣原体包涵体形态的变化，计算各浓度下子代衣原体包涵体形成单位(Inclusion-forming units, IFUs)确定最佳诱导浓度；移除处理因素，继续培养16h观察衣原体形态恢复情况，同时收集子代衣原体进行新一轮感染，计算子代IFU。
2.透射电子显微镜(Transmission electron microscope, TEM)观察不同时间点中异常体(Aberrant body, AB)的形成，实时定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测衣原体能量代谢、细菌分裂和膜结构等相关基因的转录水平；流式细胞术(Flow cytometry, FCM)、Hoechst染色和AO/EB染色检测急性和持续性感染12、24、40h时肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)诱导后的细胞凋亡率。
3.提取未感染细胞、急性感染和持续性感染12、24、40h的细胞总RNA，Arraystarv4.0人类lncRNA芯片对差异表达lncRNAs和mRNAs进行检测，qRT-PCR对5个差异mRNAs(SESN2、GBP3、FZD10、PPP1R3C和DKK-1)和4个差异lncRNAs(HIF1A-AS1、FGD5-AS1、USP30-AS1和LINC01556)在不同时间点的表达进行验证；联合运用DAVID、KEGG、STRING、Metascape和Cytoscape等软件筛选差异表达基因富集通路，Co-lncRNA软件构建lncRNA-mRNA表达谱。
4.qRT-PCR检测siRNA对FGD5-AS1的干扰效果，FCM和Hoechst染色检测干扰前后TNF-α诱导下感染细胞的凋亡率，westernblot检测干扰前后FGD5-AS1共表达分子富集通路Wnt通路中β-catenin的蛋白表达情况，IFA检测β-catenin核转位情况。
5.构建pORF5稳定过表达细胞株，qRT-PCR、westernblot和IFA对pORF5的表达进行验证，随后提取pORF5稳转细胞株和对照细胞株总RNA，Arraystarv4.0人类lncRNA芯片检测差异lncRNAs和mRNAs，qRT-PCR对8个差异表达lncRNAs(GAS5、RP11-42O15.3、H19、ZFAS1、BASP-AS1、FGD5-AS1、CRHR1-IT1和CALML3-AS1)和8个差异表达mRNAs(MAPKAPK3,DDIT3、SESN2、FZD10、MAP3K13、NKRF、CASP2和DKK-1)进行验证；联合运用软件筛选差异表达基因富集通路。
6.qRT-PCR检测siRNA对ZFAS1表达的干扰效果，westernblot检测干扰前后凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达情况，FCM和Hoechst染色检测干扰前后TNF-α诱导下感染细胞的凋亡率，随后IFA检测干扰前后Ct子代感染率。
7.分别采用ERK抑制剂(PD98059)、p38抑制剂(SB202190)和JNK抑制剂(SP600125)预处理pORF5稳转细胞株和对照细胞株后，TNF-α诱导细胞凋亡，westernblot检测Bax和Bcl-2的表达情况，随后westernblot检测ZFAS1干扰前后，TNF-α诱导下稳转细胞中MAPK通路相关分子的磷酸化水平。
8.分别用5μg/mL和20μg/mL去内毒素pORF5蛋白外源性刺激HeLa细胞，westernblot检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株，以及外源性蛋白刺激的HeLa细胞在12、24、40h时UPR相关分子BiP、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、p-IRE1α、IRE1α、ATF6、ATF4、CHOP的表达水平以及自噬相关分子LC3，SQSTM1/p62和Beclin-1的蛋白表达水平，IFA检测ATF4的核转位和LC3的聚集情况，琼脂糖凝胶电泳检测qRT-PCR扩增后XBP1mRNA的剪切情况。
9.自噬抑制剂3-MA抑制自噬后，westernblot检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株、外源性蛋白刺激的HeLa细胞在12、24、40h时自噬以及UPR相关分子的表达水平，IFA检测LC3的聚集和ATF4的核转位情况，琼脂糖凝胶电泳检测qRT-PCR扩增后XBP1mRNA的剪切情况。
10.分别采用PERK抑制剂(GSK2606414)和IRE1抑制剂(4μ8C)对UPR下游通路进行抑制，随后westernblot检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株、外源性蛋白刺激的HeLa细胞在12、24、40h时自噬以及UPR相关分子的表达水平，IFA检测LC3的聚集和ATF4的核转位情况，琼脂糖凝胶电泳检测qRT-PCR扩增后XBP1mRNA的剪接情况。
11.Westernblot检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株、外源性蛋白刺激的HeLa细胞在12、24、40h时MAPK/ERK的磷酸化情况，随后应用PERK抑制剂和IRE1抑制剂分别抑制UPR下游通路，检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株、外源性蛋白刺激的HeLa细胞中ERK的磷酸化情况。
12.应用ERK抑制剂(PD98059)抑制ERK后，检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株、外源性蛋白刺激的HeLa细胞在12、24、40h时自噬以及UPR相关分子的表达水平，IFA检测LC3的聚集和ATF4的核转位情况，琼脂糖凝胶电泳检测qRT-PCR扩增后XBP1mRNA的剪切情况。
结果：
1.IFN-γ浓度为75U/mL，青霉素G浓度为75U/mL时均可显著降低Ct感染能力(P＜0.01)，并减小包涵体体积(P＜0.05)；TEM可观察到持续性感染细胞包涵体中出现结构疏松、体积异常增大的AB而未见原体(Elementary body, EB)和网状体(Reticulate body, RB)，证实持续性感染模型的构建成功。与急性感染组(32.400±1.800)×106相比，移除IFN-γ后IFU为(12.600±0.520)×106，移除青霉素G后IFU为(14.400±1.375)×106，而未移除IFN-γ组IFU为(3.600±0.520)×106，未移除青霉素G组IFU为(3.900±0.300)×106，衣原体感染力得到部分恢复(P＜0.05)。诱导凋亡后，与正常HeLa细胞相比(33.63%)，Ct急性感染和持续性感染12h的细胞凋亡率分别为13.12%和14.77%(P＜0.05)，感染24h的细胞凋亡率分别为21.76%和18.71%(P＜0.05)，感染40h细胞凋亡率分别为25.49%(P＞0.05)和26.32%(P＞0.05)。衣原体在感染12和24h时呈现抗凋亡效应，随着感染时间延长，衣原体抗凋亡能力下降。
2.qRT-PCR结果表明，筛选的差异lncRNAsHIF1A-AS1、FGD5-AS1、USP30-AS1和LINC01556在相应感染时间点表达上调，差异mRNAGBP3在急性感染12h和持续性感染40h表达上调，SESN2、FZD10、PPP1R3C和DKK-1在相应感染时间点表达下调，差异基因变化趋势与芯片结果相一致；构建候选lncRNA分子的lncRNA-mRNA表达谱，其富集通路为“Spliceosome”，“UbiquitinMediatedProteolysis”，“OocyteMeiosis”和“WntSignalingPathway”。
3.siRNA干扰FGD5-AS1表达后，FGD5-AS1表达水平下降(P＜0.01)；FCM结果表明，TNF-α诱导凋亡后，Ct感染细胞中，干扰组凋亡率(15.05%)高于未干扰组(11.08%)(P＜0.05)。Hoechst染色结果表明，TNF-α诱导凋亡后，Ct感染细胞中，干扰组凋亡率(17.70%)高于未干扰组(11.12%)(P＜0.05)，Ct感染细胞抗凋亡能力减弱。
4.转入pORF5慢病毒载体后，qRT-PCR、westernblot和IFA结果表明pORF5蛋白在细胞中稳定过表达(P＜0.01)；提取总RNA后，qRT-PCR结果表明，差异lncRNAsGAS5、RP11-42O15.3、H19和ZFAS1表达上调，lncRNAsBASP1-AS1、FGD5-AS1、CRHR1-IT1和CALML3-AS1表达下调；差异mRNAsMAP3APK3、DDIT3、SESN2、FZD10表达上调，MAP3K13、NKRF、CASP2和DKK-1表达下调，差异基因变化趋势与芯片结果相一致。siRNA干扰后，候选lncRNA分子ZFAS1表达下调(P＜0.01)，westernblot结果表明ZFAS1干扰组中Bcl-2/Bax比值下调(P＜0.01)；TNF-α诱导凋亡后，Hoechst染色结果显示，ZFAS1干扰组凋亡率为14.49%，高于未干扰组凋亡率10.61%(P＜0.05)，FCM结果中ZFAS1干扰组凋亡率(16.02%)同样高于未干扰组凋亡率(10.90%)(P＜0.05)，pORF5稳转细胞株抗凋亡能力降低。干扰ZFAS1后，与对照组相比，ZFAS1干扰组子代衣原体IFU为(2.280±0.227)×107，低于未干扰组子代衣原体IFU(5.880±0.289)×107，衣原体感染力显著降低(P＜0.01)。
5.TNF-α诱导细胞凋亡后，与对照细胞株ERK、JNK和p38磷酸化水平相比，pORF5稳转细胞株ERK磷酸化水平增加1.77倍(P＜0.05)，p38磷酸化水平增加1.34倍(P＜0.05)，JNK磷酸化水平变化无统计学差异(P＞0.05)。MAPK抑制剂处理后诱导细胞凋亡，ERK抑制组中对照细胞株Bcl-2/Bax比值为(0.454±0.024)，pORF5稳转细胞株比值为(0.513±0.019)，两者比值无显著差异(P＞0.05)；JNK抑制组中对照细胞株Bcl-2/Bax比值为(0.418±0.057)，pORF5稳转细胞株比值为(0.513±0.019)，对照细胞株Bcl-2/Bax比值低于稳转细胞株(P＜0.05)；p38抑制组中对照细胞株Bcl-2/Bax比值为(0.427±0.110)，pORF5稳转细胞株比值为(0.380±0.072)，两者比值无显著差异(P＞0.05)。TNF-α诱导细胞凋亡后，与未干扰组ERK和p38磷酸化水平相比，ZFAS1干扰组ERK磷酸化水平无显著差异(P＞0.05)，p38磷酸化水平降低0.56倍(P＜0.01)。
6.Ct感染和pORF5蛋白的内外源性刺激均可诱导LC3转化、p62表达下调、Beclin-1表达上调，同时PERK、eIF2α、IRE1的磷酸化水平增加，BiP、ATF4和CHOP的蛋白表达水平上调，ATF6出现降解，ATF4入核，XBP1mRNA发生剪切。
7.3-MA抑制自噬后，Ct感染和pORF5内外源性刺激诱导BiP蛋白表达上调，磷酸化PERK及磷酸化eIF2α、ATF4和CHOP表达增加，XBP1mRNA发生剪切，ATF4入核；应用PERK制剂，Ct感染和pORF5刺激组中LC3转化减少，p62和Beclin-1表达未发生显著变化，细胞自噬受到抑制；抑制IRE1通路，Ct和pORF5蛋白所诱导的LC3转化减少，自噬现象受到部分抑制。
8.Ct感染和pORF5均可活化MAPK/ERK信号通路；抑制PERK，Ct和pORF5诱导的磷酸化ERK水平低于对照组(P＜0.05)，而抑制IRE1对ERK磷酸化水平无显著影响(P＞0.05)。
9.抑制MAPK/ERK通路，Ct和pORF5诱导的LC3转化相对减少，Beclin-1表达仅出现轻微增加，p62下降趋势不明显，细胞自噬受到抑制；抑制MAPK/ERK对UPR通路相关分子活化无显著影响，Ct感染和pORF5刺激后BiP蛋白表达增加，磷酸化PERK及磷酸化eIF2α、ATF4和CHOP的表达增加，XBP1mRNA剪切形成XBP1s，ATF6随时间增加而减少，ATF4发生核转位。
结论：
1.成功构建IFN-γ诱导的E型Ct持续性感染体外模型。
2.Ct急性和持续性感染均可引起宿主细胞lncRNA和mRNA发生差异表达变化，差异lncRNAFGD5-AS1通过调控Wnt信号通路，影响宿主细胞凋亡。
3.Ct分泌型质粒蛋白pORF5通过上调lncRNAZFAS1激活p38MAPK通路抵抗宿主细胞凋亡并影响子代衣原体感染率。
4.Ct和pORF5均可活化UPR通路，pORF5经UPR激活MAPK/ERK通路参与细胞自噬。
方法：
1.分别应用不同浓度的人重组干扰素γ(Interferongamma,IFN-γ)和青霉素G处理HeLa细胞后，间接免疫荧光法(Immunofluorescence assay, IFA)检测不同浓度下衣原体包涵体形态的变化，计算各浓度下子代衣原体包涵体形成单位(Inclusion-forming units, IFUs)确定最佳诱导浓度；移除处理因素，继续培养16h观察衣原体形态恢复情况，同时收集子代衣原体进行新一轮感染，计算子代IFU。
2.透射电子显微镜(Transmission electron microscope, TEM)观察不同时间点中异常体(Aberrant body, AB)的形成，实时定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测衣原体能量代谢、细菌分裂和膜结构等相关基因的转录水平；流式细胞术(Flow cytometry, FCM)、Hoechst染色和AO/EB染色检测急性和持续性感染12、24、40h时肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)诱导后的细胞凋亡率。
3.提取未感染细胞、急性感染和持续性感染12、24、40h的细胞总RNA，Arraystarv4.0人类lncRNA芯片对差异表达lncRNAs和mRNAs进行检测，qRT-PCR对5个差异mRNAs(SESN2、GBP3、FZD10、PPP1R3C和DKK-1)和4个差异lncRNAs(HIF1A-AS1、FGD5-AS1、USP30-AS1和LINC01556)在不同时间点的表达进行验证；联合运用DAVID、KEGG、STRING、Metascape和Cytoscape等软件筛选差异表达基因富集通路，Co-lncRNA软件构建lncRNA-mRNA表达谱。
4.qRT-PCR检测siRNA对FGD5-AS1的干扰效果，FCM和Hoechst染色检测干扰前后TNF-α诱导下感染细胞的凋亡率，westernblot检测干扰前后FGD5-AS1共表达分子富集通路Wnt通路中β-catenin的蛋白表达情况，IFA检测β-catenin核转位情况。
5.构建pORF5稳定过表达细胞株，qRT-PCR、westernblot和IFA对pORF5的表达进行验证，随后提取pORF5稳转细胞株和对照细胞株总RNA，Arraystarv4.0人类lncRNA芯片检测差异lncRNAs和mRNAs，qRT-PCR对8个差异表达lncRNAs(GAS5、RP11-42O15.3、H19、ZFAS1、BASP-AS1、FGD5-AS1、CRHR1-IT1和CALML3-AS1)和8个差异表达mRNAs(MAPKAPK3,DDIT3、SESN2、FZD10、MAP3K13、NKRF、CASP2和DKK-1)进行验证；联合运用软件筛选差异表达基因富集通路。
6.qRT-PCR检测siRNA对ZFAS1表达的干扰效果，westernblot检测干扰前后凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达情况，FCM和Hoechst染色检测干扰前后TNF-α诱导下感染细胞的凋亡率，随后IFA检测干扰前后Ct子代感染率。
7.分别采用ERK抑制剂(PD98059)、p38抑制剂(SB202190)和JNK抑制剂(SP600125)预处理pORF5稳转细胞株和对照细胞株后，TNF-α诱导细胞凋亡，westernblot检测Bax和Bcl-2的表达情况，随后westernblot检测ZFAS1干扰前后，TNF-α诱导下稳转细胞中MAPK通路相关分子的磷酸化水平。
8.分别用5μg/mL和20μg/mL去内毒素pORF5蛋白外源性刺激HeLa细胞，westernblot检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株，以及外源性蛋白刺激的HeLa细胞在12、24、40h时UPR相关分子BiP、p-PERK、PERK、p-eIF2α、eIF2α、p-IRE1α、IRE1α、ATF6、ATF4、CHOP的表达水平以及自噬相关分子LC3，SQSTM1/p62和Beclin-1的蛋白表达水平，IFA检测ATF4的核转位和LC3的聚集情况，琼脂糖凝胶电泳检测qRT-PCR扩增后XBP1mRNA的剪切情况。
9.自噬抑制剂3-MA抑制自噬后，westernblot检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株、外源性蛋白刺激的HeLa细胞在12、24、40h时自噬以及UPR相关分子的表达水平，IFA检测LC3的聚集和ATF4的核转位情况，琼脂糖凝胶电泳检测qRT-PCR扩增后XBP1mRNA的剪切情况。
10.分别采用PERK抑制剂(GSK2606414)和IRE1抑制剂(4μ8C)对UPR下游通路进行抑制，随后westernblot检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株、外源性蛋白刺激的HeLa细胞在12、24、40h时自噬以及UPR相关分子的表达水平，IFA检测LC3的聚集和ATF4的核转位情况，琼脂糖凝胶电泳检测qRT-PCR扩增后XBP1mRNA的剪接情况。
11.Westernblot检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株、外源性蛋白刺激的HeLa细胞在12、24、40h时MAPK/ERK的磷酸化情况，随后应用PERK抑制剂和IRE1抑制剂分别抑制UPR下游通路，检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株、外源性蛋白刺激的HeLa细胞中ERK的磷酸化情况。
12.应用ERK抑制剂(PD98059)抑制ERK后，检测Ct感染细胞、pORF5稳转细胞株及其对照细胞株、外源性蛋白刺激的HeLa细胞在12、24、40h时自噬以及UPR相关分子的表达水平，IFA检测LC3的聚集和ATF4的核转位情况，琼脂糖凝胶电泳检测qRT-PCR扩增后XBP1mRNA的剪切情况。
结果：
1.IFN-γ浓度为75U/mL，青霉素G浓度为75U/mL时均可显著降低Ct感染能力(P＜0.01)，并减小包涵体体积(P＜0.05)；TEM可观察到持续性感染细胞包涵体中出现结构疏松、体积异常增大的AB而未见原体(Elementary body, EB)和网状体(Reticulate body, RB)，证实持续性感染模型的构建成功。与急性感染组(32.400±1.800)×106相比，移除IFN-γ后IFU为(12.600±0.520)×106，移除青霉素G后IFU为(14.400±1.375)×106，而未移除IFN-γ组IFU为(3.600±0.520)×106，未移除青霉素G组IFU为(3.900±0.300)×106，衣原体感染力得到部分恢复(P＜0.05)。诱导凋亡后，与正常HeLa细胞相比(33.63%)，Ct急性感染和持续性感染12h的细胞凋亡率分别为13.12%和14.77%(P＜0.05)，感染24h的细胞凋亡率分别为21.76%和18.71%(P＜0.05)，感染40h细胞凋亡率分别为25.49%(P＞0.05)和26.32%(P＞0.05)。衣原体在感染12和24h时呈现抗凋亡效应，随着感染时间延长，衣原体抗凋亡能力下降。
2.qRT-PCR结果表明，筛选的差异lncRNAsHIF1A-AS1、FGD5-AS1、USP30-AS1和LINC01556在相应感染时间点表达上调，差异mRNAGBP3在急性感染12h和持续性感染40h表达上调，SESN2、FZD10、PPP1R3C和DKK-1在相应感染时间点表达下调，差异基因变化趋势与芯片结果相一致；构建候选lncRNA分子的lncRNA-mRNA表达谱，其富集通路为“Spliceosome”，“UbiquitinMediatedProteolysis”，“OocyteMeiosis”和“WntSignalingPathway”。
3.siRNA干扰FGD5-AS1表达后，FGD5-AS1表达水平下降(P＜0.01)；FCM结果表明，TNF-α诱导凋亡后，Ct感染细胞中，干扰组凋亡率(15.05%)高于未干扰组(11.08%)(P＜0.05)。Hoechst染色结果表明，TNF-α诱导凋亡后，Ct感染细胞中，干扰组凋亡率(17.70%)高于未干扰组(11.12%)(P＜0.05)，Ct感染细胞抗凋亡能力减弱。
4.转入pORF5慢病毒载体后，qRT-PCR、westernblot和IFA结果表明pORF5蛋白在细胞中稳定过表达(P＜0.01)；提取总RNA后，qRT-PCR结果表明，差异lncRNAsGAS5、RP11-42O15.3、H19和ZFAS1表达上调，lncRNAsBASP1-AS1、FGD5-AS1、CRHR1-IT1和CALML3-AS1表达下调；差异mRNAsMAP3APK3、DDIT3、SESN2、FZD10表达上调，MAP3K13、NKRF、CASP2和DKK-1表达下调，差异基因变化趋势与芯片结果相一致。siRNA干扰后，候选lncRNA分子ZFAS1表达下调(P＜0.01)，westernblot结果表明ZFAS1干扰组中Bcl-2/Bax比值下调(P＜0.01)；TNF-α诱导凋亡后，Hoechst染色结果显示，ZFAS1干扰组凋亡率为14.49%，高于未干扰组凋亡率10.61%(P＜0.05)，FCM结果中ZFAS1干扰组凋亡率(16.02%)同样高于未干扰组凋亡率(10.90%)(P＜0.05)，pORF5稳转细胞株抗凋亡能力降低。干扰ZFAS1后，与对照组相比，ZFAS1干扰组子代衣原体IFU为(2.280±0.227)×107，低于未干扰组子代衣原体IFU(5.880±0.289)×107，衣原体感染力显著降低(P＜0.01)。
5.TNF-α诱导细胞凋亡后，与对照细胞株ERK、JNK和p38磷酸化水平相比，pORF5稳转细胞株ERK磷酸化水平增加1.77倍(P＜0.05)，p38磷酸化水平增加1.34倍(P＜0.05)，JNK磷酸化水平变化无统计学差异(P＞0.05)。MAPK抑制剂处理后诱导细胞凋亡，ERK抑制组中对照细胞株Bcl-2/Bax比值为(0.454±0.024)，pORF5稳转细胞株比值为(0.513±0.019)，两者比值无显著差异(P＞0.05)；JNK抑制组中对照细胞株Bcl-2/Bax比值为(0.418±0.057)，pORF5稳转细胞株比值为(0.513±0.019)，对照细胞株Bcl-2/Bax比值低于稳转细胞株(P＜0.05)；p38抑制组中对照细胞株Bcl-2/Bax比值为(0.427±0.110)，pORF5稳转细胞株比值为(0.380±0.072)，两者比值无显著差异(P＞0.05)。TNF-α诱导细胞凋亡后，与未干扰组ERK和p38磷酸化水平相比，ZFAS1干扰组ERK磷酸化水平无显著差异(P＞0.05)，p38磷酸化水平降低0.56倍(P＜0.01)。
6.Ct感染和pORF5蛋白的内外源性刺激均可诱导LC3转化、p62表达下调、Beclin-1表达上调，同时PERK、eIF2α、IRE1的磷酸化水平增加，BiP、ATF4和CHOP的蛋白表达水平上调，ATF6出现降解，ATF4入核，XBP1mRNA发生剪切。
7.3-MA抑制自噬后，Ct感染和pORF5内外源性刺激诱导BiP蛋白表达上调，磷酸化PERK及磷酸化eIF2α、ATF4和CHOP表达增加，XBP1mRNA发生剪切，ATF4入核；应用PERK制剂，Ct感染和pORF5刺激组中LC3转化减少，p62和Beclin-1表达未发生显著变化，细胞自噬受到抑制；抑制IRE1通路，Ct和pORF5蛋白所诱导的LC3转化减少，自噬现象受到部分抑制。
8.Ct感染和pORF5均可活化MAPK/ERK信号通路；抑制PERK，Ct和pORF5诱导的磷酸化ERK水平低于对照组(P＜0.05)，而抑制IRE1对ERK磷酸化水平无显著影响(P＞0.05)。
9.抑制MAPK/ERK通路，Ct和pORF5诱导的LC3转化相对减少，Beclin-1表达仅出现轻微增加，p62下降趋势不明显，细胞自噬受到抑制；抑制MAPK/ERK对UPR通路相关分子活化无显著影响，Ct感染和pORF5刺激后BiP蛋白表达增加，磷酸化PERK及磷酸化eIF2α、ATF4和CHOP的表达增加，XBP1mRNA剪切形成XBP1s，ATF6随时间增加而减少，ATF4发生核转位。
结论：
1.成功构建IFN-γ诱导的E型Ct持续性感染体外模型。
2.Ct急性和持续性感染均可引起宿主细胞lncRNA和mRNA发生差异表达变化，差异lncRNAFGD5-AS1通过调控Wnt信号通路，影响宿主细胞凋亡。
3.Ct分泌型质粒蛋白pORF5通过上调lncRNAZFAS1激活p38MAPK通路抵抗宿主细胞凋亡并影响子代衣原体感染率。
4.Ct和pORF5均可活化UPR通路，pORF5经UPR激活MAPK/ERK通路参与细胞自噬。